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(無題) 削除/引用 No.5541-7 - 2016/11/10 (木) 16:55:21 - たていす おおさんの指摘が当たってそうな感じ。 N-末にシグナル配列、C末にKDELが付いているような状況だと、タグを何処に入れたらよいのか悩んでしまいますが、そんな状況なのかな。 タグを入れて、局在化配列を壊してしまったのではないかしら？ それともタグは入れていないのかな。

(無題) 削除/引用 No.5541-6 - 2016/11/10 (木) 16:23:44 - おお >エンドの局在は問題なく予想通りの場所に来ています。 もしそうなら「targeting machineryが追いつかず」という解釈が怪しくなってきませんか？エンドも同じtargeting machineryで局在するべきところに言っているはずでしょうから。その小器官自体が安定して存在して（エンドソームとかは輸送されたりして絶えず変化して言っているような印象があるけど）、エンドはそこで安定何でしょうか。そうであってもエンドも分泌されてしまうだろうから、分泌されたフラクションにもエンドの蛋白が来るはずですよね。ちょっとそのあたりも気に留めながら勧めたほうがいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5541-5 - 2016/11/10 (木) 15:14:42 - exp monさん、おおさんありがとうございます。 細胞はSaos2細胞でT抗原は発現していないので、細胞内での増幅は期待はできないと思います。 > 1-1.一過性遺伝子導入では細胞当たり数十〜数百コピーのplasmidが導入されると言われています。遺伝子導入効率を変えないためにplasmid（DNA）総量は変えずに、目的plasmidを減らしキャリアDNA(例えばインサートなしのベクターやただのpUC等）を使うと良いでしょう。 それほどまでに入っているのですね。では目的のプラスミドを減らす手は有効かもしれませんね。はい、総DNA量は変えないことが再現よく実験を行うためには重要ですね。ありがとうございます。挑戦してみます。 レンチのプラスミドのプロモータはEF1になりますので、弱い発現になるかと思います。それに血球系の細胞ではないので、EF1だと尚更低発現になると考えていました。 >またこれは条件検討にハマってしまうかもしれませんが、トランスフェクションしてから３日後、４日後とかその後一度継代するとかすれば徐々に発現が落ちてきます。うまく適度な発現量になるタイミングが見つかればそれでもいいのではと思います。 なるほど、パッセージして何回か分裂させた後に染色というのもありですね。一度WTの細胞に遺伝子導入して、条件を検討してみます。 >エンドの局在も変わりますか？ エンドの局在は問題なく予想通りの場所に来ています。 ご意見聞かせていただき、ありがとうございました！！

(無題) 削除/引用 No.5541-4 - 2016/11/10 (木) 15:01:03 - おお レンチ系云々よりもプロモーターを変えたほうがいいんじゃないでしょうか。PGKとか,,, プラスミドの量はダミープラスミド（からのプラスミドとかGFPみたいなものとか）でトランスフェクションするプラスミド量を一定にしておいて振ってうまくいくか行かないかを見ればそれで結論が出ませんか？ 細胞は何を使っているでしょうか？T-antigenが発現している細胞を使っているなら、使ってない細胞に変えるとか。 またこれは条件検討にハマってしまうかもしれませんが、トランスフェクションしてから３日後、４日後とかその後一度継代するとかすれば徐々に発現が落ちてきます。うまく適度な発現量になるタイミングが見つかればそれでもいいのではと思います。 エンドの局在も変わりますか？

(無題) 削除/引用 No.5541-3 - 2016/11/10 (木) 14:51:48 - mon >[Re:1] expさんは書きました : > 1. 一過性導入時のプラスミドの量を減らす。 1-1.一過性遺伝子導入では細胞当たり数十〜数百コピーのplasmidが導入されると言われています。 遺伝子導入効率を変えないためにplasmid（DNA）総量は変えずに、目的plasmidを減らしキャリアDNA(例えばインサートなしのベクターやただのpUC等）を使うと良いでしょう。 1-2.弱いPromoterのベクターを使うのも方法ですが、手間ですね。 > 2. レンチウイルスシステムを使った安定（低）発現系に切り替える。 CMV promoterのレンチだと一過性遺伝子導入より弱いとは言え、細胞のキャパより強すぎることもあります。こちらも弱いPromoterを使うか、ある程度制御できる誘導発現系Promoterのものが良いかも。

発現量の調節 削除/引用 No.5541-1 - 2016/11/10 (木) 14:26:11 - exp 質問があるのですが、興味ある遺伝子を一過性にリポフェクションすると、本来見られずはずの細胞内小器官へ輸送されず、細胞外に分泌されてしまう問題に直面しています。 恐らく過剰発現ゆえにゴルジから目的の細胞内小器官へのtargeting machineryが追いつかず、そのまま分泌経路に入っているのだと考えています。 そこで、発現量を抑えることに挑戦してみたいのですが、２つの方法があります。 1. 一過性導入時のプラスミドの量を減らす。 2. レンチウイルスシステムを使った安定（低）発現系に切り替える。 を考えています。1はボスからの提案なのですが、条件検討にはまりそうな気もします。 ちなみに細胞はSaos2 cell lineで、プラスミドはpcDNA3.1 (+)ベースのものです。 2は私のアイデアですが、うまくいくような気がしていますが、根拠はありません。プラスミド自体はすぐに構築可能であり、私自身もレンチ、レトロウイルス系の経験はあります。 実験目的は、内在性のものを見ることではなく、外来的に導入した遺伝子から発現するタンパク質の挙動を追跡することです。2はうまくいくでしょうか？ご意見聞かせていただけるととても心強いです。おねがいします。

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