全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.5556-9 - 2016/11/25 (金) 20:41:56 - ２３４５ BSAはどうしても血漿中の糖蛋白質や糖質の混入があるので、これがBGが高くなる原因だとレクチン会社の方から聞いた事があります。で、そのときはblocking剤なしで、TBS-Tween20でやったとおもいます。今はProtein free blocking bufferやcarbo-free blocking bufferが市販されているので、試してみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5556-8 - 2016/11/20 (日) 17:24:19 - おお ん、BSAがつかえるとして１％ってWBとかでも少し少なめだね。。。

(無題) 削除/引用 No.5556-7 - 2016/11/19 (土) 02:34:44 - おお まずはバックグランドが高いので、HRP-Streptoavidinやビオチン化ConAの濃度を下げるべきかと思います。Caについてはしっかりと書かれたプロトコールを探せばわかるでしょうから、ご自身でも調査してみてはどうでしょうか。Caが関与しているのでTRISのほうがいいというのは、面白い視点でもしかしたらそうかもしれません。バックが高いときはブロッキングの試薬を変えるというのも常套手段だと思います。 BSA自身の糖鎖はみつかってませんが、微量の糖鎖を持つものが混じっているかもしれませんね。非蛋白性のものがいいのかもしれません（PVPなど）。

(無題) 削除/引用 No.5556-6 - 2016/11/18 (金) 13:14:08 - 鼻毛カッター また、Vector社のプロトコールでは界面活性剤にTween20を使用していたと思います。Tritonが悪さをしているかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5556-5 - 2016/11/18 (金) 11:35:45 - mon 鼻毛カッターさん、情報ありがとうございます。Vector社のサイトを見ましたが残念ながらProtocolはなさそうですね。 なお以下の記述がありました。 Con A requires calcium or manganese ions at each of its four saccharide binding sites. Although these divalent metal ions are bound tightly to the polypeptide structure, buffers which can bind calcium (such as phosphate) generally should be avoided in diluting Con A, since a gradual loss in activity may occur.

(無題) 削除/引用 No.5556-4 - 2016/11/18 (金) 09:58:36 - 鼻毛カッター Vector社のビオチン化レクチンはプロトコールにPBSで希釈するように書いてあったような気がします(昔の記憶なので間違っているかも)。 メンブレンもPVDFのもので問題なかったかと思います。 ConAは感度が高いので、もっと希釈してみてはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5556-3 - 2016/11/18 (金) 09:45:37 - mon レクチンブロットは経験が無いのですが、COnAってCa+依存性結合です。 そのため、PBSは溶解（希釈）液、洗浄液には向いていないと思います。TBS+Caとか。。 ただバックが真っ黒になるのは別の理由なような（Ca-で変性するのかな？？）。 思いつきですが、BSAではなく合成高分子系ブロッキング剤(PVP,N101)やコラーゲン系ブロッキング剤(PerfectBlock)、PVDF膜ではなくニトロセルロース膜が良いかも。

(無題) 削除/引用 No.5556-2 - 2016/11/18 (金) 09:44:24 - 鼻毛カッター 昔レクチンブロットをやっていましたが、ブロッキング材にcarbo-freeのものを使うと綺麗にバンドが出た記憶があります。

ビオチン化ConAでのレクチンブロットのコツについて 削除/引用 No.5556-1 - 2016/11/17 (木) 10:25:48 - konkon トピック立てさせていただきます。よろしくお願いします。 今週から初めてレクチンブロット（ConA）を行うようになりました。 サンプルは培養細胞の無血清培地の上清です。（未濃縮） 電気泳動後に、PVDF膜を1% BSA in PBS-0.1% Triton X-100で1時間室温でブロッキングしました。 ビオチン化ConAはVectorsから購入し、5 mg/mlのものを1% BSA in PBS-0.1% Triton X-100に10 ug/mlで希釈し（500倍）、1時間室温でPVDF膜と反応させました。 その後、PBSTで5回以上洗った後、0.5 mg/mlのHRP-Streptoavidinを0.5 ug/ml (1,000倍希釈)に希釈し、1時間室温で反応させ、その後5回以上十分時間をかけて洗浄したのちにECLでX線フィルムに焼き付けました。 結果は、1秒で膜全体が真っ黒になってしまい、肝心なシグナルが見えませんでした。 先輩に聞いても、レクチンブロットで上手く行った試しがないとのことでした。私自身ウエスタンは毎日のように行っており、手技などは問題ないはずですが、ブロッキング溶液、時間、濃度、コツなどがありましたら、教えていただけるととても助かります。拙い文章で申し訳ありませんがよろしくお願いします。

全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---