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後日談の報告 削除/引用 No.5560-15 - 2017/01/22 (日) 19:20:13 - 修士一年生 前回はいろいろとご指導いただきありがとうございました。 最終的にベクターに導入，目的のコントラストを得ることができました。 脱リン酸化処理を検討した時には， セルフライゲーションはなくなりました。しかし，目的のライゲーションはうまくいかなかったです。ベクターに関しては制限酵素処理に問題はなかったようです。 インサートの制限酵素処理を念押しで， 反応時間を一時間から三時間に伸ばしました。 さらに，プレートに多めに形質転換したコンピテントセルを播種したところ なんとかクローンを一つだけ拾うことができました。 （セルフライゲーション含めてコロニーはあまり生えていない） そのベクターを発現誘導させた時， 大腸菌増殖が悪く，タンパク質を抽出しても量は少なかったです。 恐らく，発現タンパク質が大腸菌に害を与えたため ライゲーションに成功したクローンほど得ることができずに， 反応がうまくいかなかったのように見えたのではないのかと思います。（多分）

(無題) 削除/引用 No.5560-14 - 2016/11/21 (月) 23:31:17 - おお >＞空のやつらが生えてこない手を考えるより、インサート持ちのやつがより多くでるようにするというほうが有効でしょう。 >とのことでしたが，ライゲーションにおけるインサート比を上げることも その手法のひとつでしょうか？ APさんのこのコメントの旨は系がうまく働くように、それぞれの段階を確実なものにしたほうがいいということだと思います。

(無題) 削除/引用 No.5560-13 - 2016/11/21 (月) 22:41:27 - おお >脱リン酸化を行おうとしていますが，制限酵素処理したベクターが >100 fmol(200 ng)程度しかありませんが，十分な量でしょうか？ 十分な量です。わたしならその量で１０回以上ライゲーションします。気をつけてやればDNAはほとんどロスしませんし。 >（今はベクター量に対して3〜10倍量で検討しています） 通常はこれぐらいでやります。インサートの量をあげるとトランスフォーメーションの効率があるところでがくんと下がります。そういうのをうまく利用することもありますが、手探りでやるにはちょっと冒険だとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.5560-12 - 2016/11/21 (月) 18:55:35 - 修士一年生 皆さま　ありがとうございます 知らないことばかりで勉強になります >これはインサートだけではなくでプラスミドベクターもということでいいのですよね。もしそうでないならベクターのほうも切り出し精製すべきです。 ベクターもゲル抽出しています。 脱リン酸化を行おうとしていますが，制限酵素処理したベクターが 100 fmol(200 ng)程度しかありませんが，十分な量でしょうか？ （もちろん，多いに超したことはありませんし，やり直した方がいいかと思いますが・・・） ＞空のやつらが生えてこない手を考えるより、インサート持ちのやつがより多くでるようにするというほうが有効でしょう。 とのことでしたが，ライゲーションにおけるインサート比を上げることも その手法のひとつでしょうか？ （今はベクター量に対して3〜10倍量で検討しています）

(無題) 削除/引用 No.5560-11 - 2016/11/21 (月) 18:01:57 - AP どうしてもインサートなしベクターだけのクローンは生えてきますが、普通はそれ以上にインサートが入った奴が生えてくるような実験系を組んでいるわけです。 生えてきたクローンが空ばかりという場合、空のやつらが生えてこない手を考えるより、インサート持ちのやつがより多くでるようにするというほうが有効でしょう。その意味で、先に書いたような、PCR産物末端の制限酵素消化の効率が低いというようなことがあれば、対策する価値は高いです。

(無題) 削除/引用 No.5560-10 - 2016/11/21 (月) 17:44:32 - AP >各制限酵素の活性は，環状状態のベクターと反応させた時に一本鎖になることを 予備実験で確認しています。（電気泳動でバンドパターンが変わることで） プライマーにいれた末端の制限酵素サイトは非常に切れにくいようです。 そのために余分な塩基をいくつか（制限酵素によって必要数は違うと言う）外側に付けておくということはよく知られています。しかし、それでもなかなか100%ととはいかず、わたしの見積もったところでは良くて10%ぐらいなものではないかと思います。ひょっとすると、オリゴのメーカーや品質に左右されて、たまたまうちで使っているのがだめなのかもしれません。 とにかく、かなり過剰量の酵素で処理するとかしないとすんなり行きません。 むしろ、PCR産物をリン酸化して平滑末端で入れるほうが容易いくらいです。 なので、プライマーに設計した制限酵素切断末端が欲しい時は、一旦、平滑末端でベクターにいれてクローン化したプラスミドから、制限現酵素で切り出したりします。 で、言いたいことは、環状プラスミドが100%切れたからと言って、PCR産物の末端が完全に切断されているとは限らないということ。どのくらい切れているかは制限酵素処理したPCR産物だけでライゲーションしてみることです。切れていれば5'リン酸基末端が生じて、重合が起こりますが、切れていないものはモノマーのままです。やってみるとほとんどがモノマーのままで重合してバンドがラダー状にシフトアップしているのはごく一部だったりします。 >本実験では酵素処理の度にゲル抽出を行って，buffer交換を行っています。 これはインサートだけではなくでプラスミドベクターもということでいいのですよね。もしそうでないならベクターのほうも切り出し精製すべきです。

(無題) 削除/引用 No.5560-9 - 2016/11/21 (月) 12:31:39 - 痔が痛い >>PCRの末端は制限酵素で切っているのでリン酸化は必要ないのでは そうですね、平滑末端のときだけですね。なんかボケてました。。。

(無題) 削除/引用 No.5560-8 - 2016/11/21 (月) 12:03:53 - おお >あとベクターのXho IサイトとHind IIIサイトの間にinsert中には無い制限酵素サイトがあれば、ライゲーション後にその制限酵素で切ってしまえば効率が上がります。 あ、これよくやります。PCRの末端は制限酵素で切っているのでリン酸化は必要ないのでは、、、

(無題) 削除/引用 No.5560-7 - 2016/11/21 (月) 10:37:57 - 痔が insertはリン酸化していますか？ あとベクターのXho IサイトとHind IIIサイトの間にinsert中には無い制限酵素サイトがあれば、ライゲーション後にその制限酵素で切ってしまえば効率が上がります。

(無題) 削除/引用 No.5560-6 - 2016/11/21 (月) 10:06:40 - 修士一年生 ＞おお　さん ＞tracker さん 脱リン酸化を行ってみます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5560-5 - 2016/11/20 (日) 01:17:15 - おお >そういう時はライゲーションのネガコン(インサートなし)でも結構コロニー生えます これはライゲーションなしのコントロールをとればすぐに気付けたはずです。 何が起こりうるか想定しなければいけませんが、それに対してコントロールを取ることで原因を追求できて対処方法がわかるはずです。またライゲーションがうまく言っていなければ、バックグランドれべるのコロニーができ、その場合は大腸菌の中で修復されて環状になったものが取れたりします。制限酵素認識部位は潰れているでしょうけどころにーPCRでは単なるからのベクターに見えるでしょう。 何回も繰り返すより、コントロールを取りながら原因を追求していくべきかと思います。

(無題) 削除/引用 No.5560-4 - 2016/11/19 (土) 21:33:24 - tracker そうですね。切れ残りが問題になってる場合が多いです。 そういう時はライゲーションのネガコン(インサートなし)でも結構コロニー生えます

(無題) 削除/引用 No.5560-3 - 2016/11/19 (土) 19:30:45 - 修士一年生 >trackerさん お恥ずかしいお話しですが， 二種類で処理すれば，脱リン酸化はしなくてもいいと教わり 鵜呑みにしてしまい，行っていませんでした。 やってみようと思います。 この場合，脱リン酸化を行うというのは 一方の制限酵素でしか反応されていないプラスミドを除くためですよね？

(無題) 削除/引用 No.5560-2 - 2016/11/19 (土) 19:10:32 - tracker 切ったあと脱リン酸化やってます？

２種の制限酵素処理なのにセルフライゲーションしてしまう 削除/引用 No.5560-1 - 2016/11/19 (土) 19:03:12 - 修士一年生 PCR産物をベクターに導入しようとしています。 Xho I, Hind IIIで制限酵素処理を行いました。 PCR産物は一度ゲル抽出後に行っています。 各制限酵素の活性は，環状状態のベクターと反応させた時に一本鎖になることを 予備実験で確認しています。（電気泳動でバンドパターンが変わることで） 本実験では酵素処理の度にゲル抽出を行って，buffer交換を行っています。 それぞれの反応はメーカーの指示通り行っています。 形質転換後に，コロニーPCRで確認すると 空ベクターのみしかみられません。 長い事うまくいってなく困っています。 問題解決でどこから手を付ければいいのかわかりません。 どうしたらよいでしょうか？

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