全17件 ( 1 〜 17 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.5561-17 - 2016/11/22 (火) 02:08:11 - おお PCRプロダクツのスメアーなけんですが、PCRプロダクツにミスアニールした完全な２本鎖出ないものなどが混じっている可能性があります。精製過程でそういうのが外れたり、あるいは違うパターンでアニールしたりすることによって電気泳動で違う位置に流れたりです。 ということはPCRで単一に見えているバンドは意図しないBy productsが伴っている可能性があるわけで、そこは現段階でうまく行ってないんだから気をつけたらどうでしょうかということだったんですけどうまく伝わっているかな。。。

(無題) 削除/引用 No.5561-16 - 2016/11/21 (月) 17:07:18 - もち スメアが出るなら切り出したゲルからもう1度PCRしたらシングルバンドになるかもしれません。 nestedじゃなくて同一プライマーでも結構いけますよ。

(無題) 削除/引用 No.5561-15 - 2016/11/21 (月) 16:20:18 - もち 私も液量ではなくDNA量ベースで反応液を調整すべきだと思います。 普通はインサート:ベクターを2:1〜10:1くらいの比率でライゲーションすることが多いと思いますが、TAだと1:1なんでしたっけ？

(無題) 削除/引用 No.5561-14 - 2016/11/21 (月) 15:50:19 - おお ベクターは１：１と書いていますが、分子数ベースではないのですか？濃度を測って分子数ベースで１：１でやるべきと思いますけどどうでしょうか。数ナノグラムでいいはずだから、その量を電気泳動でながして見えるか見えないかの量を使うことになると思いますが。多すぎるとこれまたトラブルのもとです。 ３０分Ligationは直鎖の長いプロダクトができてトランスフォーメーションの効率を落とすからだそうです。TAベクターの場合は直鎖の長いプロダクトができるようなシステムではないですが、、、でも３０分でも十分である場合が大抵のようなのでやってみるといいでしょう。わたしはたいていどんなライゲーションでもO/Nでやっていましたので、これが話題になったときは意外に感じましが。

(無題) 削除/引用 No.5561-13 - 2016/11/21 (月) 15:23:54 - M1 とりあえず再びインサートのPCRから始めました。 精製してから泳動してさらにゲル抽出も慎重に行います ライゲーション反応液Total 5uLに対し、0.5uLずつインサートとベクターを入れようかと考えていますがバンドの濃さにより多少変えます 私はインサートが3kbもあるなら、なるべく低温度で長時間ライゲーションを行い、DNA量も少ないほうがいいと聞きましたが、30分のライゲーション反応でもいいという意見もあるのですね、そこが迷いどころではあります

(無題) 削除/引用 No.5561-12 - 2016/11/21 (月) 15:13:48 - もち コロニーが全く出ないのはおかしいですよね 単純にエタ沈でロスしてるとか？

(無題) 削除/引用 No.5561-11 - 2016/11/21 (月) 13:13:45 - 774 前も議論になったけど、ライゲーション30分で試してみるとか。 インサート3kbpは長くないです。

(無題) 削除/引用 No.5561-10 - 2016/11/21 (月) 13:02:42 - ういろう 使いやすいベクターに平滑で入れたほうが早いかもですね

(無題) 削除/引用 No.5561-9 - 2016/11/21 (月) 13:00:12 - ういろう ライゲーションのinsert比率をもっと上げてみては？

(無題) 削除/引用 No.5561-8 - 2016/11/20 (日) 14:04:30 - おお ゲルから精製してそれを電気泳動してスメアを引いているんだから、 ＞インサートはPCRで増やし精製したもののためこのインサート自体がきちんと出来ていない可能性 ここもちゃんと抑えたほうがよさそうだとおもいます。PCRのサイクル数やアニーリング温度などより厳しい条件で増やすほうがいいと思います。 全くコロニーが出ないのはなんかちょっと変だと思います。バックグランドレベルでいくらかコロニーが出るはず。

(無題) 削除/引用 No.5561-7 - 2016/11/20 (日) 13:31:51 - M1 紫外線照射→まずは写真を撮る→ゲルを切り出す　この過程を経るためどうしても10秒くらいはかかっていましたが、この時間に問題がある事を考えるとsafety dyeなど紫外線以外での発光でゆっくり安全にゲルを切り出すのが良さそうですね また勉強不足で恐縮ですが抗生剤？というのはどの段階で用いるものでしょうか？ 私の行っている実験では、PCRで3kbのインサートを作製（Taqを用いて3'末端にAを付加→ゲルから抽出）、インサートとpGEM-T（ベクター）を1:1の比率で、ligation bufferとT4 ligase（酵素）を用いて4℃でオーバーナイト→トランスフォーメーション　です。 TAきっとという事で少し気になったのは、うちのラボでは節約が多く、pGEM-Tを1/3に希釈して用いているという点です。万一ですが、この希釈したものに問題があるという可能性も考えられますね。 もう一度インサートのPCR→スメアが出なければ精製（紫外線を当てず精製）→ベクターは希釈したものは使わず希釈前のストックを使う→4℃オーバーナイト これが今行える最善でしょうか。 勉強になるため他にも気になる点等あれば何でもアドバイスが欲しいです。

(無題) 削除/引用 No.5561-6 - 2016/11/20 (日) 13:18:37 - OK 一般的に12秒はかなりの長さだと思います。 私はどうしても照射する際には1秒以内にしています。 キットは新しいですか？ 抗生剤は適切なもので、適切な濃度でしょうか？ また本題とずれますが、3kbをTaqポリメラーゼで増幅するのはエラーが多そうな気がしますね。 アメリカに私はいますが、ラボにあったTAクローニングキットが古過ぎて、新たに購入したところ一発でものがとれたことがあります。 スメアのものがクローニングを邪魔しているのかもしれませんね。 ゲル抽出の過程がシビアが条件になっているのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.5561-5 - 2016/11/20 (日) 13:05:14 - み >[Re:4] M1さんは書きました : > 紫外線照射は、Totalで12〜13秒程度ですのでそこまで大きな問題は無いと考えています。 紫外線照射は波長が重要です。 長波長に切り替えられる機器ならある程度安心。 12秒って長いですね。 260に近いものなら5秒でもダメかも。 ｱｸﾘﾙ板1枚かますなりUVﾀﾞﾒｰｼﾞ考慮する努力も必要かも。 ｽﾒｱに増幅されているのも、そもそもPCR条件が最適でなさそうですが、嘘もののﾌﾟﾛﾀﾞｸﾄでも末端にAがあれば繋がるはずだし、他のｽﾃｯﾌﾟにも問題あるのかな。

(無題) 削除/引用 No.5561-4 - 2016/11/20 (日) 12:16:44 - M1 紫外線照射は、Totalで12〜13秒程度ですのでそこまで大きな問題は無いと考えています。

(無題) 削除/引用 No.5561-3 - 2016/11/20 (日) 12:15:28 - M1 情報不足ですみません。 インサートを作製するPCRで用いた酵素はTaqポリメラーゼなのでAは付加されていると思います。 その後の精製はゲルからの抽出（EasyTrap）です。 少し気になった点は、ゲルからの精製後の、確認のための電気泳動で少しスメアがある点です。スメアがある事がどう関係してくるのかは勉強不足で私には分かりませんが、欲しい長さのDNAのシグナル自体が一番強く確認は出来ている次第です。

(無題) 削除/引用 No.5561-2 - 2016/11/20 (日) 12:08:33 - OK 3'末端にAが1塩基付加されるようなポリメラーゼをPCRに使用されていますか？ 3'末端にAが1塩基付加されていないと、TA cloning はできませんので、まずそこを確認したいところです。 PCR後の精製はどのようにやられていますか？ゲルから抽出でしょうか？ 紫外線照射の問題は大丈夫でしょうか？

インサート3kbのライゲーションがうまくいきません 削除/引用 No.5561-1 - 2016/11/20 (日) 11:55:07 - M1 pGEM-TをベクターとしたTAクローニングでライゲーション反応が起きていないらしくコロニーが出来ません。 インサートが3kbと長いためライゲーション反応は4℃で20時間前後やっています。 インサート：ベクターは１：１で、どちらも0.3uLずつの時や0.5uLずつなど少量で試しています。 インサートはPCRで増やし精製したもののためこのインサート自体がきちんと出来ていない可能性もありますが、もしライゲーションがうまくいっていないと仮定すると、どのような条件検討をすればよろしいでしょうか。

全17件 ( 1 〜 17 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---