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(無題) 削除/引用 No.5577-9 - 2016/11/30 (水) 19:47:32 - Tok CCRさん、ごめんなさい。大きなこと言っておいてCCR1は私の範囲外でした… ただ、ちょっと、ラボで前に調べた人のメモ程度の記録がありまして、R&D SystemsのはBioLegendのものより暗いということが書いてありました。データはついていませんでしたが、実際両者のTDSを見ると、 https://www.rndsystems.com/products/human-ccr1-pe-conjugated-antibody-53504_fab145p http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd191-ccr1-antibody-9954.html どちらもblood monocytesを染めたものを出していますが、明らかにR&D Systemsのものは暗いですよね？ あと、そのメモには4℃やRTで染めるよりも37℃で染めた方が良かったとありました。どれくらいの差が出るかはわかりませんが… 37℃となると染めている間のinternalizationの可能性も出てくるので、ダイレクト標識抗体を使うのがいいのではないでしょうか？またFITCよりは明るいPE, APCの方がFACSには向いていると思います。 参考程度に…

(無題) 削除/引用 No.5577-8 - 2016/11/30 (水) 18:38:09 - CCR Tokさん CCR1です。論文を見る限り、Millennium Pharmaceuticalsの2D4というクローンがヒトでは一番良いように思ったのですが、武田関連と思われるこの会社のウェブを見ても、市販品としては見つかりません（探し方が悪いのでしょうか？）。なので、自分としては第二選択と考えていたR&Dのマウスモノクロを購入しテストしています。他にお勧めの抗体があれば、教えて頂けると助かります。 昨日、シグナルを増幅するため、試しにビオチン化抗マウス抗体をはさみ、ストレプトアビジンAPCで検出する形にしてみたところ、RPMI-8226ではうまく行きました。リガンドを加えて下がるかどうか、それが阻害剤で抑制できるかどうかを、今週中に確認したいと思っております。 THP1の方は、やはり駄目で、CCL3がautocrineで出ているのではないかと疑っています。培養条件が悪いような気がしているのですが、、、、 腫瘍マウスに阻害剤を投与した場合のPDアッセイも今後必要で、受容体のFACSを使いたいと考えています。マウスの場合はさらに困難（良い抗体があまりなさそうなので）と予想されるのですが、こちらについてもお勧めの抗体があれば、教えて頂けると助かります。

どのCCRですか？ 削除/引用 No.5577-7 - 2016/11/30 (水) 13:03:39 - Tok 私もいくつかのケモカインレセプターをFACSで解析していたことがあるので、場合によっては使える抗体をおすすめできるかもしれません。 もし具体的なCCRの名前を出したくない場合はひとつだけコメント。R&D SystemsのDTSではapplicationにFACS使用可とあるのですか？その場合でも、transfectanatを染めたデータだけの場合と、実際のnatural cellを染めているデータが付いている場合とがあるが、前者の場合はnatural cellではやったけど染まらなかったんだなと自分でやってみて感じてます。

(無題) 削除/引用 No.5577-6 - 2016/11/29 (火) 05:58:26 - CD 細胞種にこだわりがないのであれば目的のケモカイン受容体を適当な細胞株に強制発現させてみるのも手のように思います。

(無題) 削除/引用 No.5577-5 - 2016/11/28 (月) 18:57:45 - CCR CDさん、固定による抗原性への影響が多少気になりますが、細胞内染色でのFACSはやるべきですね。早急に実験を組みます。どうもありがとうございます。 Internalizationについては、細胞内ドメインを認識する別の抗体で行った免疫染色（共焦点顕微鏡観察）の結果からの推測です。大部分が細胞内で顆粒状の分布を示し、細胞膜への分布がかなり少ないように見えます。ただ、染色の特異性がどうなのか、ちょっと自信がないので、細胞内FACSでも確認してみます。 最終的な目標は、阻害剤のpharmacodynamics評価のためのマーカーとして、受容体internalizationを使えるようにする事にあり、まずは細胞表面での受容体発現をベースラインで定量評価できるようにする必要があります。なので、細胞表面FACSが必須と考えています。

(無題) 削除/引用 No.5577-4 - 2016/11/28 (月) 18:39:32 - CCR おおさん、どうもありがとうございます。 ウエスタンについては、７回膜貫通型受容体という事で凝集の問題があります。かなり前にここでご意見を伺った事があり、尿素添加の低温条件で変性することにより、かなり改善されましたが、完全なモノマーでの検出は無理です（ダイマーと思われるバンドとの混在になります）。一応ウエスタンで検出可能ではありますが、これがFACSでの検出に十分な量かどうかは不明です。

(無題) 削除/引用 No.5577-3 - 2016/11/28 (月) 09:05:45 - CD ＞培養中にinternalizeされている可能性を疑っています Internalizeしてるかどうかは、permeabilizeしてから染色すれば判断がつきそうですがいかがですか？ ヒトはどうか知りませんが、マウスのCCケモカイン受容体抗体はFACSに向かないものが多い気がしています。

(無題) 削除/引用 No.5577-2 - 2016/11/28 (月) 08:37:42 - おお WBを同時にやるといいかもしれません。mRNAの発現は十分な発現があることをどのように判断してますか？

THP-1/RPMI8226でのケモカイン受容体FACS検出 削除/引用 No.5577-1 - 2016/11/28 (月) 00:18:25 - CCR ヒト単球系細胞株THP-1及びヒト骨髄腫細胞株RPMI-8226を用い、CCケモカイン受容体の検出をFACSで試みていますが、難渋しています。これらの細胞株でのmRNA発現は確認しましたが、細胞表面発現が低い事が予想されたので、間接染色で行っています。一次抗体はR&Dのマウスモノクローナル、二次抗体はInvitrogen (molecular probe) のchicken anti-mouse-alexa488を使っており、human Fc block (BD)でブロックしています。 特に、細胞培養の過程で問題があるのではないかと疑っており、培養中にinternalizeされている可能性を疑っています。エンドトキシンが低い血清を使うべきなのか、血清飢餓は必要か、autocrine ligandが分泌されている可能性はどうか、など分からない事が多く、文献を見ても詳しく書かれていなかったり、論文によって結果が異なっていたりします。同じような実験をされた経験のある方がいらしたら、アドバイス頂けると助かります。

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