全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

コピペなんですが、参考になるかも 削除/引用 No.5586-14 - 2021/03/16 (火) 12:39:36 - mont アプライする容量(volume)が前の時より増えていませんか？ 以下、ThermoFisherのトラブルシューティングからのコピペです。 私も知りませんでしたー。 Barbell shaped bands are a result of loading too large of a sample volume. When a large sample volume is loaded, part of the sample tends to diffuse to the sides of the wells. When the run begins and the sample moves through the stacking portion of the gel, the sample will incompletely stack causing a slight retardation of the portion of the sample that diffused to the sides of the wells. This effect may be intensified for larger proteins, whose migration is more impeded in the low concentration acrylamide of the stacking gel. To alleviate the problem, we recommend concentrating the protein and loading a smaller volume. This gives a "thinner" starting zone. https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/technical-reference-library/protein-electrophoresis-western-blotting-support-center/protein-gel-1d-electrophoresis-support1/protein-gel-1d-electrophoresis-support-troubleshooting.html

(無題) 削除/引用 No.5586-13 - 2016/12/06 (火) 22:53:26 - たていす >InvitrogenのNuPAGE systemのready to useのものを使っております。 >濃度が3-8%のTris-Acetate Gelです 「NuPAGEのことはメーカーに聞きなさい」ということだと思います。これは、メーカーのclosed-technologyだろうし、私はNuPAGEなど高くて手が出ないので、想像しか言えない。 使っているゲルを先に言わないと、当然だけどopen technologyのLaemmliのSDS-PAGEを前提に答えていたと思います。それともNu-PAGEはもはや常識なのかな？

(無題) 削除/引用 No.5586-12 - 2016/12/06 (火) 09:22:15 - おお もしかしたら量のが多いほうがいいというのは検出感度などに関係する可能性があるかもしれないと思いました。確かに両端にシグナルが偏る傾向は程度のさがあれど見れるような気がしますので、検出感度が下がると端のほうが強ければそこが目立つようになりますから。何らかの事情で検出感度が下がってきている可能性はないでしょうか。あとはトランスファーのあとポンゾーなどで染めて流れ具合を毎回チェックしておくと、サンプルの流れ方が変われば気がつくかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5586-11 - 2016/12/06 (火) 02:56:39 - WB 皆様ありがとうございます。 マーカー（Bio-RadのPrecision Plus Protein Kaleidoscope）は綺麗に流れています。ここを考えると指摘があったようにたんぱく質の問題なのかもしれません。 直輝様の指摘にある >目的のタンパク量が多い方がＨ形はちょっとマシになるような気はします を試してみようと思います。今までなぜか、「濃度が濃すぎるからかも」と考えててapplyするタンパクを減らして（2 ugとか）みたら、Hの縦棒と横棒がぶつかるところだけが濃くなり、他の部分、特に横棒部分、が薄くなるという結果になっていました。 Gelは自作ではなくて、InvitrogenのNuPAGE systemのready to useのものを使っております。濃度が3-8%のTris-Acetate Gelです。 その後、-80Cに保存しておいたソニケーション済みかつ濃度調整済みの以前は綺麗に流れたサンプルに、以前使ったのと同じサンプルバッファと2-MEを加えてボイルして（以前と同じ操作）もう一度メンブレンを作ってみたところ、H型のバンドが現れました（マーカーは綺麗）。一月にも満たない保存期間の違いに影響されるというのは考え づらいと思います。おおさま仰るように、なにか前回と違う操作をしたのかもとは思うのですが、今のところ思いつかないままです。

(無題) 削除/引用 No.5586-10 - 2016/12/05 (月) 16:28:18 - おいも屋 全ウェルにサンプルバッファーをついかしてゆっくり流すと改善されるかも。

(無題) 削除/引用 No.5586-9 - 2016/12/05 (月) 03:52:06 - あqswでfrgtyふじこhj ゲル作ったらコーム差したまま湿潤状態のタッパーか何かに入れて（乾かなければなんでもいい）４Cに保管して翌日以降２〜３日以内くらいに使って電気泳動すると上手く行くかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.5586-8 - 2016/12/04 (日) 09:38:00 - おお 糖蛋白とかはスメアになったりしてきれいなシャープなバンドにならないことはあります。

(無題) 削除/引用 No.5586-7 - 2016/12/04 (日) 08:59:01 - たていす サイズマーカーも、サンプルと区別つかない程度にH型になるのですか？

(無題) 削除/引用 No.5586-6 - 2016/12/04 (日) 08:47:21 - abc ちなみにゲルとバッファーはどちらのメーカーでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5586-5 - 2016/12/04 (日) 03:56:58 - 直輝 タンパクの種類によってはＨの形というか、三角が二個くっついたようなバンドになりやすかったりしますね。 理由は、サンプルのアプライ時にウェルの端にまとわりつきやすいStickyなタンパク質だからではないかなと推測しています。 残念ながら対策は分かりませんが、目的のタンパク量が多い方がＨ形はちょっとマシになるような気はしますね。

(無題) 削除/引用 No.5586-4 - 2016/12/03 (土) 19:14:31 - おお 何度やってもそういう状態でしょうか。 まあ冷静というかいろいろ考えてみてください。結局何かが違うからそういうことが起こっているはずですし。たまたまそういうことがあって次は大丈夫で原因解明に至らないようなこともあるでしょうけど、そういうことが解決できるのも技量のうちかと思いますので。 追加でもう一つ思いついた可能性として、ところで、泳動バッファーにSDSを入れ忘れたとかないでしょうか？それとマーカーはきれいに流れてますか？マーカーがきれいに流れているなら、サンプルの方に原因があるかもと推察できますよね。 もしマーカーの流れ方もわるいなら、ゲルが自作ならAPSやTEMEDがヘタってきているということもあるかもです。

(無題) 削除/引用 No.5586-3 - 2016/11/30 (水) 10:22:23 - WB おお　様 ありがとうございます。コンディションは完全に同じです。 サンプルバッファーは同じもので、ゲルとバッファは逆に最近新しく購入したものです。新しいものに変えた直後にこういう現象が起こり始めたわけではないです。 ソニケーションも同じようにやっているはずだと思います。時間はタイマーみながらやっていますし。機械の設定が変わったりしていないかもチェックしてみましたが、同じままです。 サンプルも、以前と同じように作っているつもりです。細胞に入れる刺激が変わったりはしていますが、vehicleコントロールは前の実験と完全に同じ作り方を出来るようになっていて、このサンプルでもHの形のバンドになってしまっています。 さっぱり原因がわからず、途方にくれています。

(無題) 削除/引用 No.5586-2 - 2016/11/29 (火) 14:26:33 - おお 電圧などのコンディションも一緒ですか？ ソニケーションの強度とかが上手くコントロールできていないとかないでしょうか。DNAなどの夾雑物がふえると汚くなることがあります。 サンプルバッファーはおなじものを使いましたか？グリセロールは徐々にサンプルをWellの両端の方によせる作用があります。濃度やWellに入れてからの時間でその度合が変わってきます。 ゲルやバッファーが古くなってヘタっているって言うことはありませんか？

ウェスタンブロットでバンドが汚いのをなんとかしたい 削除/引用 No.5586-1 - 2016/11/29 (火) 13:23:35 - WB よろしくお願いします。 ウェスタンブロットをしているのですが、バンドが汚いのです。 通常は（ある程度）水平に真っ直ぐなバンドになると思うのですが、最近なぜか、バンドがHの形になり、左右の縦の棒ばっかり濃く出て、水平の棒が薄いというようなバンドになってしまいました。以前は普通にきれいな真っ直ぐのバンドが出ていたのですが。以前と同じようにやっているつもりなのですが、理由が全くわからなくて途方に暮れております。 こうなってしまう理由と、その対策をご存知の方おられたら教えていただけないでしょうか？こうバンドが汚いと定量もままならずに困っています。 泳動前にwellは洗って（ピペットで）います。サンプルは1% Tritonを含むnon-denaturing lysis Bufferで細胞を溶かしたものをsonicationでホモジェナイズしたもので、5から10 ugのタンパクを１レーンに流しております。タンパク載せすぎということはないと思います。

全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---