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(無題) 削除/引用 No.5592-8 - 2016/12/03 (土) 09:54:46 - おお 4-Oxalocrotonate tautomeraseって言うのがあって６０アミノ酸ぐらいらしいです。 ttps://en.wikipedia.org/wiki/4-Oxalocrotonate_tautomerase 酵素活性としては http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cbic.201200371/epdf これだと混ぜで吸光度ではかれどうだけど。。。 実際にお考えの実験で実用的かどうかわかりません。

(無題) 削除/引用 No.5592-7 - 2016/12/02 (金) 19:55:26 - 中年 大腸菌のbeta-galactosidaseのalpha complementationはほ乳類培養細胞でも動くようです。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC38007/ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC145750/

(無題) 削除/引用 No.5592-6 - 2016/12/01 (木) 19:26:52 - ミニレポーター ＞おおさま、monさま、totoさま さまざまな案をありがとうございます。 GFPやnanolucを分割したり、別のsmall peptideで発現制御できるような手法があるのですね、浅学で全く知りませんでした。 FLAG-HAによるサンドイッチELISAも含め、検討してみたいと思います。 ＞monさま 「長さの制限」はそれこそが実は本実験のキモ（示したいこと）で、 とある特殊な配列（プロモーター領域）の下にあるRNA転写産物と、別のあるタンパク質の相互作用が、長さに応じて変わることが私たちの予備実験およびほかのグループからの報告でわかっています。（予備実験では 300nt 程度が閾値。RNA自体の配列に由らず「長さ」がファクターであることは、ほぼ間違いありません。）その相互作用が、翻訳に関わっているかを調べたい、という実験になります。 たくさんの案を示していただきましたが もしほかにもアイデアがありましたら、お聞かせいただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.5592-5 - 2016/12/01 (木) 18:54:35 - toto FAP、Fluorogen activating peptideを使えば、50アミノ酸くらいで外から基質を加えることで蛍光を持たせることができます。基質は http://spectragenetics.com/products/vectors-for-expressing-fluorogen-activating-proteins/fap-technology-overview/ から買えます。高いですが、赤外蛍光で割と明るく検出できます。配列は文献や学位論文検索で見つかります。この基質は比較的無害な印象はありますが、毒性がないともいいきれないかな。

(無題) 削除/引用 No.5592-4 - 2016/12/01 (木) 18:24:08 - mon 短いpeptideは検出が面倒です。どうせなら8xFLAGではなく、サンドイッチELISAが出来るように、(3xFLAG-HA)3とか? あるいはより感度の高いSpilit Luciferaseの NanoBIT:11aa＋＠ https://www.promega.jp/products/protein-purification-and-interactions/protein-interactions/nanobit-complementation-assay-for-protein-interactions/ Split Gaussia luciferase (GLuc) = NGLuc (amino acids 1–93) and CGLuc (amino acids 94–169) は、長いか。 内容が不明だけど、「実験の都合上、挿入遺伝子の長さが200塩基以下であることが望ましい」というのは本当かな?？長さは関係ないのでは?

(無題) 削除/引用 No.5592-3 - 2016/12/01 (木) 17:17:52 - おお ttp://www.pnas.org/content/112/10/2948.full こんなのもあるね。HISタグの蛋白を発現させれば検出できるような。

(無題) 削除/引用 No.5592-2 - 2016/12/01 (木) 17:08:42 - おお エスタブリッシュした系でないのでうまくいくかチャレンジングな方法ですが、いくつか。 細胞にステイブルにGFPなどを発現させておいて、リポーターにはshRNAやアンチセンスを入れてやり、発現による抑制をみる。ただGFPは半減期が長いので迅速に動いてくれるかわからないので、、、ルシフェラーゼとかLacZとかのほうがいいのかなぁ。半減期が短いGFPも売られていたようだけど、、、 GFPをC末とN末に分けて、両者が接触するように仕向けるとGFPとして蛍光活性を持つようになるっていうのもありますね。 ttp://www.intechopen.com/books/biosensors-emerging-materials-and-applications/recent-progress-in-the-construction-methodology-of-fluorescent-biosensors-based-on-biomolecules ここの図の２。えっと１６０アミノ酸あたりで分けているから、、、C-末がそれでも８０アミノ酸ぐらいあるか、、、まだ長いですね。ドッキングするためのドメインを付け加えるともっと長くなる。 それじゃあ２つに分けたGFPの片方をMS2コートタンパク質とFusionして、もういっぽうをPP7コートタンパク質と融合して細胞に安定発現させておく。 リポーターはMS2 RNAコートタンパク質認識配列とPP7RNAコートタンパク質認識配列を含むRNA。両者とも約２０ベース程度だから余裕で２００ベースに収まるはず。このRNAが発現すると、GFP N末とC末のフラグメントをブリッジしてくれるので蛍光活性がみられる。 MS2コート蛋白とその認識RNA配列をつかったRNA局在、トランスポートなどに実験は実際によくやられているので、そういう意味ではワークする可能性が高いと思う。 ttp://nar.oxfordjournals.org/content/30/19/4138.full ttp://www.nature.com/nrm/journal/v16/n2/full/nrm3918.html またGFPを２つに分ける方法も色々工夫されて違うシステムがあるようです。 ttp://www.nature.com/articles/srep02854#ref8 ttp://www.nature.com/articles/srep02854#ref8 ttp://web.stanford.edu/group/boxer/gfp.html これなんかだとC-末の４０アミノ酸ぐらいがあればいいし、上記のようなブリッジ役をしてくれるものがなくてもできそうですし。

ミニレポーター 削除/引用 No.5592-1 - 2016/12/01 (木) 15:48:29 - ミニレポーター いつも、参考にしております。 現在ある実験系をデザイン中で、ご相談させてください。 プラスミドに、なんらかのレポーター遺伝子を組み込みたいのですが 実験の都合上、挿入遺伝子の長さが200塩基以下であることが望ましいです。 レポーターの発現は、タンパク質レベルで検出したく、転写されたmRNAの検出（定量PCR、ノーザンなど）は実験の目的上適当ではない状況です。 nanolucよりもさらに小さいレポーター遺伝子を探しており、あるいはウェスタンでの検出でも構わないと考えております。 実験系にはヒト培養細胞を用いるため ・遺伝子長200塩基以下 ・ヒトには存在しない（あるいは検出系をウェスタンとする場合、例えばマウス由来のそのタンパク質を発現させて、ヒトのホモログと抗体が交差しない） といった条件を満たすタンパク質で、何かよい候補がありましたらご教示ください。 いまは、8xFLAG（タグのみ）を発現させたらどうだろう、などと考えていますが…

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