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(無題) 削除/引用 No.5597-7 - 2016/12/06 (火) 10:35:41 - おお 経験のない人が適当なことを言っていると思って聞いてほしいのですが、 私ならなるべくサイトゾルと細胞外の長い部分を含む一回膜を通貫している領域を選ぶかもしれません。細胞内外の比較的親水的な領域を含むので、もしかしたら大腸菌発現でより扱いやすいかもと思います。まあ不溶画分にきても免疫はできますし、尿素や界面活性剤存在下でもレジンにカップリングはできますから、アフィニティーカラムは作れなくもないです。 で細胞内外のドメインを免疫しているので、うまくいくと細胞外の配列だけでアフィニティー（ペプチドでも、リコンビナントでも）、あるいは細胞内だけの配列でアフィニティーをかけるとそれぞれのドメイン特異的な抗体が精製できる可能性があります。 血清で十分満足な特異性がWBで見られるなら、上記のことができることはとりあえず気に留めておいて、そのまま使うかかんたんなIgG精製を行ってプールしておいてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5597-6 - 2016/12/05 (月) 19:23:17 - あqswでfrgtyふじこhj 20~30aa残基くらいならペプチド合成で作って、キャリア蛋白質にコンジュゲートして抗原とし、（ここまではお金あれば全て外注で可能。予算的にあれならばペプチド合成まで委託して、コンジュゲーションは自分でやる）ウサギに免疫するのがよいのではないかとおもう。ていうかペプチドはもっと短く(10~20くらい）でいいとおもう。 気をつけるのはその配列が他に相同性の高いものがない、いいかんじの疎水性／親水性比、適当にバルキーなアミノ酸が混じってる、膜貫通域やその近傍でない、糖鎖結合部位など既知の翻訳後修飾部位（Uniprotで調べられる）を含まない、とかしか思いつかないです。抗原作成受託もしてるペプチド合成の会社なら、そういうのの経験豊富で、その配列の抗原性とか、ペプチドの可溶性予測とか、あるいはアルゴリズム的なものとかそういうノウハウの蓄積があるので、過去の似たような事例も踏まえて（コンサルト料が必要かもしれないけど）よりbetterな配列の予測などの相談にのってくれるとおもう。１つだと不安なので何社かあたってみたほうがいい。いずれにせよ、うちらが考えるよりは成功率は確実に高まるとおもう。 あと、作成したペプチドの一部はアフィニティ精製担体作成用に使う。

(無題) 削除/引用 No.5597-5 - 2016/12/05 (月) 13:34:25 - み N末から第１膜貫通領域直前までの範囲に対する抗体。 第６膜貫通領域直後からC末までの範囲に対する抗体。 最低この２種類をリンコンビナント蛋白または合成ペプチドで作製を試みる。 必要であれば細胞外領域のペプチドを標的とした抗体も作製すれば穴明け処理なしで染色できたり場合によりFACSもできるかも。 APさんが指摘しているように膜貫通領域を含めなければ問題ないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.5597-4 - 2016/12/05 (月) 13:07:50 - AP >最悪WBでワークするものでもいいのなら、大腸菌に不溶性画分に来ても、変性条件下で精製したものを免疫すればいいのでは？？ 免疫原を問題にしているのではなく、抗血清をアフィニティ精製するためのハプテンタンパク質が不溶性では困ると言っていると思いますが。 免疫原としては不溶性タンパク質でも可溶化する必要はありません。

(無題) 削除/引用 No.5597-3 - 2016/12/05 (月) 13:04:36 - AP それは膜貫通領域やシグナル配列など疎水性アミノ酸リッチなストレッチがタンパク氏の多くの領域を占めることが原因なので、20-30 aaでしかも親水性のペプチドならその心配は杞憂になるかのうせいがたかい。それぐらいのペプチドなら合成ペプチドでもいけますね。

(無題) 削除/引用 No.5597-2 - 2016/12/05 (月) 13:02:59 - 斎藤飛鳥推し 最悪WBでワークするものでもいいのなら、大腸菌に不溶性画分に来ても、変性条件下で精製したものを免疫すればいいのでは？？

膜タンパク質に対する抗体作製 削除/引用 No.5597-1 - 2016/12/05 (月) 12:59:49 - Haruka いつも勉強させてもらっております。 現在ポスドクとして研究しており、6回膜貫通型の膜タンパク質に対する抗体作製を考えております。膜タンパクではなかったのですが、大学院時代に標的タンパク質に対する抗体作製がなかなかうまくいかず大変苦労した経験があるので、今の研究を早く進めるためにも最短時間で抗体作製を成功させたいと思っております。作製した抗体はWBと免疫染色に使用予定ですが、最悪WBだけでも何とかなると思います。 今考えている作製方法は、 C末の親水基の比較的多い20〜30アミノ酸のリコンビナントタンパク質を作製→ウサギに免疫→血清をカラムで精製 なのですが、膜タンパク質に対する抗体精製は、可溶化分画にリコンビナントタンパク質が得られないなど難渋することが多いと聞いております。 もし膜タンパク質に対する抗体作製のTipsなどをお持ちの方がおられましたら、是非アドバイスなどをお願いいたします。

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