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(無題) 削除/引用 No.5604-6 - 2016/12/09 (金) 14:41:52 - AP 30分〜１時間冷ますとかいうのは条件設定として機能しないですね。 ボリュームによって、容器の形状によって、外気温によって、冷め方は違いますから。手抜きしないやり方は（私家版でない、出版されているプロトコールや製品マニュアルに書かれているのは）、６０℃なり７０℃なりのウォーターバスにつけて平衡化するんですな。スターラーで撹拌させながら冷ますまったくのは勧められていないはずです（気泡を抱き込んでしまう）。 十分冷ませとか冷めてからEtBrを入れろというのは、どちらかというと化学的特性からというより安全性のため（やけどや、熱にたいする屈筋反射による事故誘発）だと思います。 それとプラスチック製のゲル版が熱で変形するというのもあって、昔は６０℃とか５５℃とか結構しっかり冷まさないといけませんでしたが、最近の製品は耐熱性が高くなっていて、やろうと思えば加熱直後で冷まさなくてもキャストできたりします。

(無題) 削除/引用 No.5604-5 - 2016/12/09 (金) 12:45:22 - stu 口伝のプロトコールは色々な仕様があると思いますが、書籍となってるプロトコール集では大概冷ましてからEtBrを入れると書いてあります。 30分冷ますとか容器に触れるぐらいまで冷ますとか60℃まで冷ますとかあるようです。 一般的な基本プロトコールができるようになってから手抜きプロトコールにした方がよいのでは。

(無題) 削除/引用 No.5604-4 - 2016/12/08 (木) 23:19:09 - おお まずよく溶けるまでレンジにかけるべきだと思います。沸騰して直後でもエチブロはおそらく大丈夫だと思いますが、５分ぐらい静置したほうが良いでしょう。なぜなら沸騰直後は突沸して手にかかったりするとやけどします。手じゃなく顔とか、目とかだと大変なことになります。 思い出してみると、エチブロを入れるタイミングは私は結構ラフで、沸騰させるガラスボトルを汚染させたくないからゲルトレイにエチブロを乗っけてから、アガロース溶液を注いでまんべんなく行き渡るように振ったりもしたことがあります。ただ濃いアガロースだと均一にするのが難しいかもしれません。また濃いアガロースは特に泡が噛まないように混ぜる必要があるかもしれません。 ＞結果、職場のやり方のほうが写真に白い大きなもや？ これはレンジをした時点でアガロースが溶けてなかったか、時間を置きすぎてアガロースが部分的に固まってしまった可能性があるのでは？時間だけで機械的に作業しているなら、中の状況をよく把握してない可能性がないかと。。。 あなたのやり方であなたのでではうまく行っているのだから、それでやればいいのかと思いますけど、突沸だけは注意してください。もしある程度の時間静置するとしたら６０度ぐらいに設定したWater bathにつけておくといいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.5604-3 - 2016/12/08 (木) 20:47:22 - NOAA 急いで書き込んだものでわかりづらくて申し訳ありません。 早速のご返答ありがとうございます。 聞きたくて、解決したい事は 1. 電子レンジでアガロースを溶かしたあとにすぐに添加すると、アガロースが溶けない、沸騰して出た泡がきえない、電子レンジから出した直後の為熱すぎて発色しないと言われてしまうこと。エチブロは沸騰くらいの温度でも変性してしまうのでしょうか。 2. アガロースが電子レンジで沸騰ししっかり溶けて、かつ30分から1時間冷ましてからエチブロを加える。〔電子レンジ出したときからスターラーで撹拌しています。〕 この2点です。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.5604-2 - 2016/12/08 (木) 20:11:12 - AP 何が聞きたくて、何を解決したくて何を聞こうという質問なのかよくわからないんですけれど、 >結果、職場のやり方のほうが写真に白い大きなもや？みたいな発色してバンドが見えなくなるゲルが多くあることがわかりました。 >これは流す直前にエチブロを添加しているのでアガロースにエチブロがしっかり撹拌されていないためなのでしょうか。 これは実際の作業と結果を見ていない外部の人間に聞かれても困るんじゃないですか。 >しかし、今の職場でそれをやるとアガロースが溶けない、沸騰して出てきた泡が消えない、熱すぎて発色しない等いわれてしまいます。 これは起こることもないことだし、それを疑う根拠もないです。たまたま違う作り方をしたときになにか別の理由で失敗した人がいて、作り方を変えたせいだと思い込んだとしか思えない。 >1、アガロースが電子レンジで沸騰ししっかり溶けて、かつ30分〜1時間冷ましてから必ずエチブロを加える こういう作り方でひとつ確実に起こりうる問題は、 攪拌で空気が溶けこんだままゲル化してしまうことです。 ゲルに溶け込んだ空気は、使用前は見えなくても、泳動して温度が上がると膨張してゲルの中に細かい気泡を生じ、水玉模様のようになってしまいます。撮影の邪魔になったり、泳動、分離の妨げになったりします。 熱いうちに攪拌すれば、熱と液の粘性も低さ、また固化するまでの時間が長いため気泡も抜けやすいです。冷めてから攪拌した場合は、適度な温度のバスに空気が抜けるのに十分な時間浸けておくとか、減圧や超音波でガス抜きするか（これはエアロゾルで汚染を生じる危険性がある）ですね。

アガロースゲル作成時におけるエチブロについて 削除/引用 No.5604-1 - 2016/12/08 (木) 18:33:39 - NOAA 初めまして。 NOAAと申します。 いま現在、わたしの職場でどうしても気になっている点がございますので質問させていただきます。 今職場で0.7%と2%のアガロースゲルを作成し電気泳動で使用しております。 ゲル作成時に私の職場では、 1、アガロースが電子レンジで沸騰ししっかり溶けて、かつ30分〜1時間冷ましてから必ずエチブロを加える。 2、エチブロを添加後すぐにゲル板に流す。 これとは別に、泳動槽にゲルをセットした時点でもエチブロを加えております。 このようなルールが定められております。 私はこれまで学生の頃も前の職場でもエチブロは沸騰くらいの熱さなら問題ないと教えられ、アガロースが溶けた直後にエチブロを加えていました。 私自身でも調べたりし、エチブロの性質を再認識した上で問題ないと思いその工程通り作業を進めておりました。 しかし、今の職場でそれをやるとアガロースが溶けない、沸騰して出てきた泡が消えない、熱すぎて発色しない等いわれてしまいます。 また、このやり方と私のやり方でゲルを作り、泳動も流し比較しました。 結果、職場のやり方のほうが写真に白い大きなもや？みたいな発色してバンドが見えなくなるゲルが多くあることがわかりました。 これは流す直前にエチブロを添加しているのでアガロースにエチブロがしっかり撹拌されていないためなのでしょうか。 またこれらの理由は、本当なのでしょうか。 職場の上司に聞いてもそうとしか言わないのでとても不安になりこの場をお借りし質問させていただきました。 わかりにくい内容とは思いますが、ご返答していただけるととてもありがたいです。 よろしくお願いいたします。

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