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(無題) 削除/引用 No.5605-4 - 2016/12/09 (金) 11:03:18 - おお 293T細胞はT antigenが入っているのでプラスミドにSV40oriが入っていれば細胞内でプラスミドが増殖します。なので例えばトランスフェクションの効率が一緒でも発現量は１０倍とか１００倍とか違ってくるでしょう。 プロモーターを強いものにすると底上げできる可能性はあります。U2OSやSaos2細胞ならもう少し効率上げれないかなぁ。。。ちょっと使ったことは殆どないのだけど、よく使われる細胞なので。。。

(無題) 削除/引用 No.5605-3 - 2016/12/09 (金) 10:40:17 - み pEGFP-N1をトランスフェクションのポジコンに使用されていますが、 プロモーターも違うし、蛋白ターンオーバーも違うだろうし、細かいことを言えば、プラスミドサイズや精製度が異なればトランスフェクト効率は下がるだろうし。 EF1と各細胞との相性も影響するでしょう。

(無題) 削除/引用 No.5605-2 - 2016/12/09 (金) 10:19:10 - 774 293T細胞と比べて細胞あたりの発現量が低くて、染まってないように見えるのではないでしょうか？ ウェスタンで発現は確認できていますか？ もしEF1で免疫染色に十分な発現量が得られないなら、 プロモーターをCMVIEに変えてみるのは手かもしれないですね。

ある特定の細胞でプラスミドがワークしないです。 削除/引用 No.5605-1 - 2016/12/09 (金) 10:00:51 - 牟田 お世話になります。 C末に3つのミクタグを付けた330アミノ酸ほどのタンパク質を293Tで発現させ、48時間後にミク抗体で染色し、プラスミドがワークしていることを確認しました。また細胞抽出液でもミク抗体で予想位置にバンドを認めました。もちろんコントロール細胞は染まらずです。 次に細胞の種類を変え、U2OSやSaos2細胞にトランスフェクションしました。 並列のウェルにて、pEGFP-N1も導入しており、トランスフェクションは1-2割です。（低いですが、免染なので問題ないかと思っています。） にもかかわらず、ミク抗体で全く染まりませんでした。 そのプラスミドは293Tでワークしています。この実験はニ度繰り返しました。 プラスミドはEF1プロモータになっています。これが上記細胞株では有効でないのでしょうか。 ご意見聞かせていただけますと幸いです。 よろしくお願い致します。

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