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(無題) 削除/引用 No.5624-5 - 2016/12/17 (土) 18:48:06 - 芋 ＞細胞種はグルタミン酸作動性neuronとGABA作動性neuronの混在だろうし、シナプスに焦点をあてても興奮性シナプスと抑制性シナプスが混在しているでしょう。 上記のことについては、まだ勉強不足なのでしっかり検討したいと思います。初代培養についての分かり易い教科書みたいなものや、論文などがあればいいんですがなかなか見つからないですね。こまめに論文探しをしてみようと思います。 ＞問題とされているダメージが本当に興奮毒性なのかは知りませんが、APVでも添加してみて改善されるなら興奮毒性なのかもしれません。 APVについては確かに考えてみました。まだ実行に移していないですが、グルタミン酸受容体について勉強してからやってみたいと思います。 ＞E16くらいから大脳皮質ではgliogenesisが起こるでしょうからコンタミしているgliaの比率も海馬由来のものとは違うと想像します(AraCで増殖を止めていても）。そのため皮質由来の培養はE17より早めにすることが多いと思います。もちろん用途にもよりますが。 確かにアストロサイトなどグリア細胞の混在は否定できないなと思っています。ただ、論文によっては大脳皮質由来の神経細胞培養で、day7あたりから98%以上がMAP-2(+), GFAP(-)になると記載されているものもありました。1%以下の割合のコンタミでもだいぶ影響はあるかもしれませんが、E17より早めの採取も考えてみます。ありがとうございます。 それにしてもアストロサイトなどが多く含まれていたら、神経細胞の過剰な興奮はなんとなく抑えてくれそうな気もします。主観的な意見で、何の根拠もないですが。 まだまだ勉強不足なのでしっかり調べたいと思います。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.5624-4 - 2016/12/17 (土) 15:32:27 - み 大脳皮質と海馬では神経細胞と一言でいっても異なる細胞ですね。 錐体細胞を考えてもおそらく場所が違えば発現している遺伝子群も違うでしょう。 細胞種はグルタミン酸作動性neuronとGABA作動性neuronの混在だろうし、シナプスに焦点をあてても興奮性シナプスと抑制性シナプスが混在しているでしょう。 このあたりは過去にだいぶん調べられているのでは。 確かに海馬由来の方がたくましい樹状突起とシナプスが形成されますね。 問題とされているダメージが本当に興奮毒性なのかは知りませんが、APVでも添加してみて改善されるなら興奮毒性なのかもしれません。 それとE16くらいから大脳皮質ではgliogenesisが起こるでしょうからコンタミしているgliaの比率も海馬由来のものとは違うと想像します(AraCで増殖を止めていても）。そのため皮質由来の培養はE17より早めにすることが多いと思います。もちろん用途にもよりますが。 総じて単純には比較できません。

(無題) 削除/引用 No.5624-3 - 2016/12/17 (土) 14:10:36 - 芋 み　さん 早速のお返事ありがとうございます。 記載が不足していましたので追記させていいただきます。 大脳皮質から採取した細胞は10cm dishに2.4x10~6cell/ml、海馬から採取した細胞は6cm dishに1.0x10~5cell/mlの密度でまいています。 大脳皮質の細胞を6cm dishに1.0x10~5cell/mlの密度でまいても、やはり海馬の神経細胞より早く過剰興奮が起きてダメージをおってしまいます。 細胞密度以外に、大脳皮質と海馬で異なる神経細胞の性質というものがあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5624-2 - 2016/12/17 (土) 14:05:44 - み >[Re:1] 芋さんは書きました : 海馬ではPLL coatの6cm dishに1x10~5cell/ml、大脳皮質では2.4x10~6cell/mlでMEMα培地を用いて撒きます。 また、なぜ海馬と大脳皮質から同時期に採取した神経細胞でここまで成長が違うのか教えていただけないでしょうか？さらに、海馬の神経細胞の方が軸索がより太く、丈夫なようにも見えます。 二種類の細胞間で２４倍も細胞密度が違うのですか？ 単純に比較できませんね。 おそらく高密度の方では栄養が足りてなくて細胞障害のようなことが起こっている気がします。

神経細胞のprimary culture 削除/引用 No.5624-1 - 2016/12/17 (土) 13:48:28 - 芋 初めて投稿させていただきます。 現在、Icrマウス、妊娠17日目から海馬または大脳皮質を採取して神経細胞の培養実験をしています。 簡単に工程を説明しますと、海馬または大脳皮質を採取した後、パパインソリューションで15分間インキュベートし、Dnaseを使用します。その後に海馬ではPLL coatの6cm dishに1x10~5cell/ml、大脳皮質では2.4x10~6cell/mlでMEMα培地を用いて撒きます。3時間後にAraC入りのNeurobasal, B-27, PSF, Glutamaxの培地に置き換え、以後は3日おきに半量培地交換（この際はAraCなし）を行います。 ここで、海馬から採取した神経細胞ではday5-6あたりからシナプス形成が観察できはじめ、day14-15あたりでRNAや蛋白を回収しています。 しかし、大脳皮質で採取した神経細胞ではday4-5あたりからシナプス形成が観察でき、day8頃には海馬のday14-15あたりと同レベルのシナプス形成（←主観的な見た目です）がみられます。さらにday9-10では軸索がチリチリし始め、突起が切れ出します。神経細胞のシナプス形成が過剰興奮してくると聞いたことはあるのですが、この突起が切れ始める現象は具体的にどんなことが起こっているのでしょうか？また、なぜ海馬と大脳皮質から同時期に採取した神経細胞でここまで成長が違うのか教えていただけないでしょうか？さらに、海馬の神経細胞の方が軸索がより太く、丈夫なようにも見えます。 ちなみにどちらの場合も細胞数は色々検討してみましたが、上の数が顕微鏡上では密度やシナプス形成が上手く出来ているという印象で、その数字を採用しています。 説明不足だとは思うのですが、宜しくお願いします。

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