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(無題) 削除/引用 No.5630-8 - 2016/12/20 (火) 18:54:40 - たていす あなたの質問１，２ですが、「断定的にはそうは言えないでしょ？」だと思います。むしろ、そうでない可能性を考える（潰す）ほうが研究をすすめる上で良いだろうなと思います。 細胞は正しくランダム増殖しているだろうか？という点。 細胞の処理によりある種の同調を受けてしまうと、特定の細胞周期の細胞が一過性に増加するので、見かけ上、S期の細胞が増えたように見えたり、別の時には、G2/Mの細胞が増えたように見えることがありそうに思えます。 つまり、あなたの細胞処理に依存するだろうと思います。 BrdU染色は、どこかのありがちな染色キットを使っているのだろうから、どのキットを使っているかを最初に言うべきだろうね。言えないのであれば、どうしようもないのでメーカーに直接聞くのが良いんじゃない？

(無題) 削除/引用 No.5630-7 - 2016/12/20 (火) 17:26:44 - おお ＞→BrdUと核染色を同時に行うkitを用いておりますので，問題はないかと思います。 こういうふうに言われると少し不安に感じるのですが、、、まあ細かいことはわからないので使用経験のあるひとのコメントを待ちましょう。

(無題) 削除/引用 No.5630-6 - 2016/12/20 (火) 17:12:34 - おお >WST-1の代謝活性増加により払拭することは難しいでしょうか？ その実験系で活性と細胞数の関係が刺激前でも刺激後でも変わらないことを確かめていますか？ タイムポイントなどと言うけど、、、哺乳動物だと分裂にかかる時間を考慮するとそんな実験によってばらつくほどずれないと思うけど、酵母とか使ってるんでしょうか？ 一つ言えることはDNA合成が促進されることを期待しておいて、確実にそれが見れるタイミングでBrdu を加えてないのは実験のデザインが悪いんじゃないかと思ってしまいます。 とにかくBrduの取り込みが確実に上がることを示さないとDNA合成が促進されていることは言えませんから、ちゃんとそれが見れるようなデザインを組んでから、必要があれば更に細胞周期を見たほうがいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.5630-5 - 2016/12/20 (火) 17:06:49 - 細胞周期 アドバイスありがとうございます。 BrdUと同時にDNA量を蛍光色素で検出しているのですか？結構難しいことのように思えますBrdUを検出するには変性させますし、変性すると２重鎖に結合する色素がDNAと結合しませんよね。BrdUの検出と細胞周期の実験は分けてやったほうがいいのでは？ →BrdUと核染色を同時に行うkitを用いておりますので，問題はないかと思います。 BrdUなんかは発色させてプレートリーダーで読むとかキットになっているやつもありますよ。 →プレートリーダーのキットも検討しましたが，特殊なラボウェアのため，そのままプレートリーダーに持ち込めず，操作が増えてしまうため，より正確なFACSを選択しております。

(無題) 削除/引用 No.5630-4 - 2016/12/20 (火) 16:49:44 - おお ふと思ったのですがBrdUと同時にDNA量を蛍光色素で検出しているのですか？結構難しいことのように思えますBrdUを検出するには変性させますし、変性すると２重鎖に結合する色素がDNAと結合しませんよね。BrdUの検出と細胞周期の実験は分けてやったほうがいいのでは？ BrdUなんかは発色させてプレートリーダーで読むとかキットになっているやつもありますよ。

(無題) 削除/引用 No.5630-3 - 2016/12/20 (火) 16:25:27 - 細胞周期 コメントありがとうございます。 sが増えるなら、g1／0が減るでしょうね・ g2/mがふえるのは、g2/mでブロックがかかっているとも見れる。 →仰るとおり，SあるいはG2/Mが増える時はいずれにせよ，G0/G1は減少しています。G2/Mでブロックがかかった可能性についてですが，WST-1の代謝活性増加により払拭することは難しいでしょうか？セルカウントについても行ってみましたが，バラつきが大きいためか，有意差は得られていません。 DNA合成が起こってないと何れにせよ、増植が起こっているとは言いにく。g2/mがふえるのは、g2/mでアレストがかかった状態 →細胞数が増加しているという事象が前提で，G0/G1が減少してG2/Mが増加した場合，あるタイムポイントではS期が増えていて（DNA合成亢進），時間経過にしたがってそれがG2/Mの増加に移行し，そのタイムポイントを測定したとは考えられませんでしょうか？ お手数おかけしますが，よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.5630-2 - 2016/12/20 (火) 13:41:26 - おお sが増えるなら、g1／0が減るでしょうね・ g2/mがふえるのは、g2/mでブロックがかかっているとも見れる。 DNA合成が起こってないと何れにせよ、増植が起こっているとは言いにく。g2/mがふえるのは、g2/mでアレストがかかった状態 刺激前にg2/mアレストがかかってて刺激を加えて、そのアレストが解除されるなら、細胞数は増えるけど、そういう場合は、g2/mは減る。 もう少し慎重に色々考えたほうがいいと思う。 細胞数は、カウントしてみましたか？

G2M期およびS期の増加について。 削除/引用 No.5630-1 - 2016/12/20 (火) 10:13:10 - 細胞周期 細胞周期の考え方について，ご教示いただければ幸いです。 未処理の細胞に対して，ある処理をした細胞の代謝活性の亢進（WST-1 assay）が確認できました。 そこで，そのメカニズム解明のひとつとしてBrdUを細胞に取り込ませ，細胞周期をFACSにて解析しております。 その結果について，処理群のS期（BrdU取り込み細胞）が未処理の細胞に対して増加したという結果が得られたら，DNA合成の亢進によって細胞数が増加し，その結果代謝活性の亢進が確認されたと考えられると思います。 しかし，何度か同じ試験を行った結果，S期の細胞が増加する場合とS期は変化ないがG2/M期の細胞が増加する場合のどちらも得られています。 このような場合，以下の2点についてアドバイスいただければ幸いです。 �@S期の増加またはG2/M期の増加という結果のぶれは，実験回によって細胞回収のタイミングが微妙にずれているから（G2/M期が増加した時は回収のタイミングが遅かった？）と考えるのが妥当か？ �AS期の割合は変化なく，G2/M期の細胞が増加した場合でも，細胞増殖に繋がる結果として解釈してもよいのか？ いくつか細胞周期についての論文を拝読しておりますが，基本的に「S期の細胞数の増加→細胞増殖」というものしかみあたらないため，質問させていただきました。 お手数おかけしますが，よろしくお願い致します。

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