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イントロンが短い場合のプライマーセット トピック削除
No.5637-TOPIC - 2016/12/25 (日) 21:29:51 - sakuri
SYBR GREENを用いたリアルタイムPCRを行っています。
ある遺伝子についてプライマーセットを検討しているのですが、
この遺伝子のイントロンが長くても500bp程度なのです。
より短いイントロンを挟んだプライマーセットではゲノム由来の産物が増えてしまいました。

そこで、500bp程度のイントロンを挟んだプライマーを作ってみようと思っています
しかし、今回の遺伝子の場合、イントロンが500bp程度、目的の産物が150bp程度だとすると、
ゲノム由来の産物が650bp程度なのでこちらも増幅されてしまいそうな気がするのです。

みなさまのご経験で、リアルタイムPCRでは650bpというのは増幅されてきますか?

プライマーを作ってPCRをかけてみろと言われそうですが、貧乏なラボなので、難しいのが現状です。

元のサンプルが非常に微量なRNAであること、発現量が低いターゲットであることが原因なのか、DNase処理してもゲノム由来が増えてきてしまいます。

二つのエクソンにわたるプライマーも考えたのですが、スプライシングバリアントがあって設計しづらいです。

わかりにくい文章で申し訳ありませんが、このような設計しづらい場合の対処法など教えていただけたら大変ありがたいです。
 
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No.5637-6 - 2016/12/26 (月) 12:38:54 - IHC?
非常に微量なRNAだとそもそも色々とブレやすくて問題がありますが、そこは増やせないのでしょうか?
私なら同じ群の5サンプルをまとめて1サンプルにし、RNA抽出します(ここでgDNAは結構減らせるので。ただしサンプルが5×5=25など大量に必要になります)
gDNA除去を頑張るのが一番いいでしょう

他の方が言うようにPrimerなんて安いものですので、最初に少なくとも2セット作って、効率などが測定に適しているものを使うようにした方が結局総コストは安いと思いますが。。。

ボスとよく話をしてみては?

(無題) 削除/引用
No.5637-5 - 2016/12/26 (月) 02:32:35 - おお
世の中イントロンがない遺伝子を増幅している人もいるわけで、、、またよりゲノムのコンタミが減らせるRNAキットが出回っているようです。

一層のことプライマーをエクソンをまたいだ状態で設計すればどうですか?

(無題) 削除/引用
No.5637-4 - 2016/12/26 (月) 00:16:14 - AP
そりゃ系に使用されている酵素のよって違うだろうよ。でもまあ、大抵は150 bp増やす条件で650 bpは容易に増えるでしょうな。
それよりゲノムDNAの排除を頑張った方がいいんでは。

(無題) 削除/引用
No.5637-3 - 2016/12/25 (日) 23:04:39 - sakuri
無駄撃ちを嫌うラボなので(貧乏だから)、次に作るプライマーも、
ワークする確立が高いということを納得させないと買ってくれそうもありません。

最初から長いイントロンを挟んだプライマーを作れば良かったのに、
という指摘もあろうかと思いますが、まずは既報のプライマーから
試した方が良いという指示でした。

(無題) 削除/引用
No.5637-2 - 2016/12/25 (日) 21:55:16 - 774R
リアルタイムPCRができるのにプライマー代の数千円が出せないのが謎すぎます。

イントロンが短い場合のプライマーセット 削除/引用
No.5637-1 - 2016/12/25 (日) 21:29:51 - sakuri
SYBR GREENを用いたリアルタイムPCRを行っています。
ある遺伝子についてプライマーセットを検討しているのですが、
この遺伝子のイントロンが長くても500bp程度なのです。
より短いイントロンを挟んだプライマーセットではゲノム由来の産物が増えてしまいました。

そこで、500bp程度のイントロンを挟んだプライマーを作ってみようと思っています
しかし、今回の遺伝子の場合、イントロンが500bp程度、目的の産物が150bp程度だとすると、
ゲノム由来の産物が650bp程度なのでこちらも増幅されてしまいそうな気がするのです。

みなさまのご経験で、リアルタイムPCRでは650bpというのは増幅されてきますか?

プライマーを作ってPCRをかけてみろと言われそうですが、貧乏なラボなので、難しいのが現状です。

元のサンプルが非常に微量なRNAであること、発現量が低いターゲットであることが原因なのか、DNase処理してもゲノム由来が増えてきてしまいます。

二つのエクソンにわたるプライマーも考えたのですが、スプライシングバリアントがあって設計しづらいです。

わかりにくい文章で申し訳ありませんが、このような設計しづらい場合の対処法など教えていただけたら大変ありがたいです。

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