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(無題) 削除/引用 No.5698-13 - 2017/02/01 (水) 05:57:40 - aso 私も動物舎へ道具一式を持って行っていますよ。 抗凝固剤無しで採血すると30min程度で目視レベルで凝固してしまいますし、微少な血小板凝集(2-3個の凝集塊)はもっと早い段階で起きていますので、抗凝固処理までの時間を限りなく短縮することが血小板を取り扱う時には非常に重要です。 あと気になるのは、picotaro様を含めてラボメンバーが本当にほしいものが血清なのか血漿なのかという事です。 血清であれば、ヘパリナイズされていないキャピラリーを使えば今まで通りの操作で正しいサンプルが得られます。 血漿であれば、心採血の時の採血量のバラツキがヘパリンの終濃度に影響するのがちょっと心配です。

(無題) 削除/引用 No.5698-12 - 2017/01/30 (月) 22:19:24 - おお エッペンドルフ社純正はちょっと高いでしょうけど、他社も出していると思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.5698-11 - 2017/01/30 (月) 22:17:59 - おお Low binding tipsなどもあって、微量のqPCRなどでも使われていると思います。疎水性になるように処理されているので、水分をはじくようになっています。吸着によるロスが気になる実験には他にも使えるので、ラボで一ケースぐらいおいておいてもいいのかなと勝手に思ってます。

(無題) 削除/引用 No.5698-10 - 2017/01/30 (月) 21:15:02 - picotaro Google検索してみたら、エッペンドルフ社のLoBind Tubesという製品がみつかりました。なるほど、用途に応じていろいろな商品が開発されているのですね。研究費を考えるとわざわざ自分だけ違うチューブの購入は難しいですが、今後の参考にさせて頂きます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.5698-9 - 2017/01/30 (月) 12:11:08 - おお どうしてもチップなどについたものが気になるのであればLow binding 処理されたものを使えば改善するかもです。

(無題) 削除/引用 No.5698-8 - 2017/01/30 (月) 11:49:37 - picotaro 血小板数の検討のご経験が豊富でいらっしゃるのですね、頼もしいです。貴重なアドバイスありがとうございます。 我々の研究室は、マウス室が別の棟にあり、かつ生きたまま持ってくるのが禁止されているため、全部のマウスからサンプルを取って実験室にもって帰ってきてそれから処理するのが常です。しかし、ヘパリンTBSを入れたチューブなどを持って行って、１匹ごとに採血したらすぐに入れてしまった方がよいかもしれませんね。 また相談させていただくかもしれませんが、お時間がありましたらまたぜひご指導くださいませ。

(無題) 削除/引用 No.5698-7 - 2017/01/28 (土) 06:11:29 - aso 私の経験則ですが、採血にかかる時間がトータルで1h-2hであっても、各サンプルがきちんと採血出来て適切な抗凝固剤濃度になっていれば血小板数に変動はありません。 採血の熟練度がそのまま反映されると考えて良いと思います。 >あとから500測り取る方法だと、マウスの数が多い場合、最初と最後で凝固の程度が違って血小板や凝固因子の濃度に差が出てしまうかもしれないですね。 1匹目採血→500uL移す→2匹目採血→500uL移す…とやれば抗凝固剤を加えるまでの時間はだいたい揃いますよね？ 血液の放置時間がpicotaro様の実験でどの程度影響するかについては実際に調べてみないとわかりませんが、まずは比較する対象同士で差が出ないように実験を組めば良いのではないかと思います。 わりと一般的な状況(例えばコントロール群と薬剤処置群各10匹ずついる)の場合、一匹ずつ交互に採血していけばひとつの群の中で1匹目と10匹目では採血後の放置時間は異なりますが、群ごとの時間には差が出にくいですよね。その上でデータを解析して許容範囲を探れば良いんじゃないですかね。

(無題) 削除/引用 No.5698-6 - 2017/01/26 (木) 17:12:42 - picotaro ありがとうございます。 わたしの周りではみな、麻酔して眼窩からでキャピラリー何本も使って採血し、途中で心停止して出なくなったら急いで開胸して心臓から引く、という方法でやっています。仰る通り、本来は血漿ですね、みな血清と言っています。自分がふだんいかに不正確な会話をしているか気づかされました。 次回は深麻酔で最初から心穿刺してみたいと思います。 あとから500測り取る方法だと、マウスの数が多い場合、最初と最後で凝固の程度が違って血小板や凝固因子の濃度に差が出てしまうかもしれないですね。 シリンジの精確さとどっちもどっちかもしれませんが。。。 そもそもFACSは定量性が低いと教わりましたので、採血後の放置時間の影響がないシリンジ法で検討してみようと思います。 作業はひとりで、血小板を扱っている者がほかにいないので助かりました。ご親切な回答を本当にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.5698-5 - 2017/01/26 (木) 11:16:14 - aso 500 uL取るときにもキャピラリーを使っているのですね。 採血用キャピラリーはたしか一本で100-200 uL程度しか採れないと思うのですが、何本か使うという感じでしょうか。 眼窩からキャピラリーで採る時はキャピラリーのエッジで血管に傷をつけて出血したのを毛細管現象を利用して採るわけですが、これは比較的組織因子などが混入しやすい方法ですので、何本も繰り返すと凝固しやすいキャピラリーが混じる危険性が高まると思います。 一般的に大量に採血したい場合、深麻酔下もしくは安楽死後にシリンジに25-G程度の針をつけて心臓あるいは下大静脈から取ります。この方法で1 mL取れます。 抗凝固剤濃度をシリンジの目盛りレベルで合わせれば良いのであれば予めシリンジの中に抗凝固剤を入れておき、必要量まで採血すれば良いです。 ピペットマンのレベルで正確に合わせたいなら、抗凝固剤無しのシリンジで採血していったん空チューブに血液を移し、そこから必要量を抗凝固剤入りのチューブに移せば良いです。手技の熟練度は確かに関係しますがそんなに急がなくても凝固しませんよ。可能であれば採血する人とピペットマンを使う人の2人で作業すると楽かもしれません。 ちなみにヘパリン採血されているので遠心後に回収されているのは血漿だと思います。

(無題) 削除/引用 No.5698-4 - 2017/01/24 (火) 11:38:34 - picotaro はい、チップの中に、の間違いです、すみません。 リバース法だなんて研究室の先輩も知りませんでした！今度からTweenを吸うときにも使ってみようと思います。また粘ちょうな液体用のツールもあるのですね、大変勉強になりました。ありがとうございます。 FACSで、50は全血や洗浄全血を用いた血小板数測定やグリコプロテインの分析に用います。 チューブに200 μl TBS/heparin(20 U/ml)を用意しておいて、そこに50μlの血液を入れろというプロトコルです。 仰るように、ピペットマンの方が簡単そうです、ヘパリンで濡らしておいて尻尾から吸い取ってみます！ありがとうございます。 採血はいつも、retroorbitalでヘパリン処理したキャピラリーを用いて行い、エッペンチューブに取れるだけ取っています（少なくとも700くらい取れる）。 500の場合、やはり100 μl TBS/heparin(20 U/ml)入りのチューブに500の血液を入れろというプロトコルなのですが、採血時キャピラリーを通じて採血用エッペンチューブに入れた時点で、あるいはそこからチップで吸い取った時点で固まってしまうのではないか、という心配です。実験用のチューブに移す際にチップをprewetさせておく、というのはやってみようと思いますが、採血時に用いるチューブにヘパリンを入れてしまうと、採血の量がばらばらなため、ヘパリンの最終濃度がばらつく気がしてしまいまして。それくらいは無視でしょうか？いつも血清保存のためそのまま遠心をかけてしまいますが、ヘパリン処理されたキャピラリーを使ってもチューブの中でどんどん凝固が進んでいるのではないかと想像しています。 お忙しい中ご回答ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.5698-3 - 2017/01/24 (火) 10:34:14 - aso 正確な量を量り取る目的と要求の度合いがちょっとよくわかりません。 50uL取るときと500uL取るときで目的が違うのですか？ 私の場合、50 uLならマウスの尻尾からヘパリンでプレウェッティングしたピペットマンで取ります。毛細管よりも規定量取るのが楽です。 500 uLの場合は当然麻酔なり安楽死後の全採血ですよね。シリンジにヘパリンを必要量吸っておいてから採血すれば凝固しません。 チップに残る血液は全てのサンプルで同量だと考えて無視、というのも１つですが、通常フローサイトメトリーに血液の原液はサンプルとして濃すぎるので希釈すると思います。 そういう状況であれば、例えば450 uLの希釈液を準備しておいて血液50 uLを加えてピペッティングでチップを洗いつつ希釈、という事も出来ると思います。

(無題) 削除/引用 No.5698-2 - 2017/01/23 (月) 11:34:35 - 中年 「チューブの中に血液が」は「チップの中に血液が」の誤りでしょうか。 粘稠な溶液の場合はリバース法で測り取ると良いですよ。 http://www.learningatthebench.com/pipetting-guide2.html ポジティブディスプレイスメント方式のピペットが使えれば理想的ですが。

マウス全血、精確な量をチューブに移したい 削除/引用 No.5698-1 - 2017/01/22 (日) 16:07:54 - picotaro マウスを用い、ヘパリン採血管で、後眼窩または尻尾から採血し、50μlないし0.5mlをチューブに移したいのですが、ふつうにピペッティングすると、チューブの中に血液が残ってしまって精確な定量ができそうにありません。50μlの場合は、目盛り入りの毛細管で採血して、アダプターを付けて押し出すことができそうでそれらを購入しようと考えましたが、500μlという多い量はどうしたらよいのでしょうか？チップに残るくらいの血液は無視でしょうか。すぐに凝固してしまいそうな気がして心配です。目的は、血小板のフローサイトメトリーです。どうぞ宜しくお願い致します。

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