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(無題) 削除/引用 No.5727-9 - 2017/02/03 (金) 15:24:50 - おお 私なら１５mlのチューブに３mlのTrizolを入れておいて、凍結してあるサンプルを凍結した状態でふたを開けて、数百マイクロのトライゾールを１０００マイクロLのチップでとって、凍結したサンプルにかけながら溶かしていき、チューブからひっくり返して凍結したサンプルが出そうになったら１５mlのチューブにドボンと落としてすぐ蓋をして激しくふる。凍結チューブに残ったものが気になるならそこに少量のトライゾールを加えて回収する。 要するにですよ、室温や３７度に上げたくないんですよ。ほんというと凍ったままポリトロンなんかでトライゾール中で砕いて迅速に懸濁してしまいたいんですよ。チューブが邪魔でそれができないから、トライゾールをピペットで加えながらなるべく温度が上がらないうちに混ざるようにしたいわけです。 ちょっと予備実験的なことをやってみる方が良いかもしれません。 そういえばTissueとかだと。凍った組織をトライゾールとハイブリバッグなどに入れてハンマーで叩いて砕くって言うやり方もあるようだけど、凍結チューブ蓋だけ外して袋に入れてトライゾールも入れた状態でハンマーで叩くとだめかな。。。チューブPPだから割れないか、割れてバックに穴が空くかな、、、

(無題) 削除/引用 No.5727-8 - 2017/02/03 (金) 14:49:21 - Chip おお様 ＞＞クライオでスライスを作ってそれをそのままTrizolとかやることはあると思うので、凍結したときの状態を保ったまま、近い状態でRNAを回収しようと思うなら、凍結したものを迅速にTRizolに掘り込むのがいいのではないかと思うわけです。 なるほど．次のようなプロトコールを考えました． １．凍結したPBMC浮遊セルバンカーを素早くとかす（37℃ウォーターバス） ２．そのまま，クライオチューブごと遠心（1500rpm, 5min） ３．上清であるセルバンカーをすてる． ４．細胞ペレットをTORIZOLでとかす．（バッファーで2回ほど洗った方が良いでしょうか？洗浄による細胞のロスを避けたいと思います） ５．RNA抽出作業へ移る．

(無題) 削除/引用 No.5727-7 - 2017/02/03 (金) 10:27:15 - おお >一般的なプロトコールがありますでしょうか？ そもそも保存してた細胞を培養に戻して、しっかり増えるとか活きがいい状態になってからRNAを取るのが大抵で、それをしないのを一般的といえるかといえばそうでないわけで、、、 例えば組織など凍結させておいた場合（特に免疫染色でも対応できるようになど）、クライオでスライスを作ってそれをそのままTrizolとかやることはあると思うので、凍結したときの状態を保ったまま、近い状態でRNAを回収しようと思うなら、凍結したものを迅速にTRizolに掘り込むのがいいのではないかと思うわけです。

(無題) 削除/引用 No.5727-6 - 2017/02/03 (金) 08:58:03 - Chip みなさま，大変参考になるご助言ありがとうございます． フェムト太郎 様 ＞＞試しに一本融解してRNA抽出を行い、RIN値を調べてみれば良いのではないでしょうか？ コントロールの設定も含め，ご助言ありがとうございます．まずは，ここからスタートですね． おお様 ＞＞凍ったものをTrizolなどに掘り込んで迅速に処理したい気がする。 凍ったものをTORIZOLで直接溶解は想定外でしたが，なるほどと思います．実際に行ったことがない方法ですが，一般的なプロトコールがありますでしょうか？ ＣＤ様 ＞＞ちなみにただの興味なのですが、SNP解析するとなるとそれを前提にしたドナーの同意が必要となる気がするのですが、20年前のサンプルに対する倫理審査ってどうなるのですか？ 20年前の同意書に，ゲノム解析の同意も含めていたようです．

(無題) 削除/引用 No.5727-5 - 2017/02/03 (金) 04:42:15 - CD 約1年保存のPBMCは使ったことがあり、1ヶ月保存のものと比べてPCRのかかりが悪かった、ということはなかった記憶があります。 20年となるとなんとも言えませんが、どれだけ保存タンクの管理状況が良かったか、にもよるように思います。自動で液相の高さを調節してくれるようなタンクなら大丈夫かもしれませんし、自分たちで液体窒素を定期的に継ぎ足す必要のあるタンクだったら上の方のサンプルはダメかもしれない。 保存状況が上と下でかなり違うでしょうから、1つのサンプルのRINが良かったからといって、全部のサンプルのRNAがIntactとは言えないですよね・・・。 ちなみにただの興味なのですが、SNP解析するとなるとそれを前提にしたドナーの同意が必要となる気がするのですが、20年前のサンプルに対する倫理審査ってどうなるのですか？

(無題) 削除/引用 No.5727-4 - 2017/02/03 (金) 00:32:42 - おお 溶かしてから集めないでなるべく凍ったものをTrizolなどに掘り込んで迅速に処理したい気がする。

(無題) 削除/引用 No.5727-3 - 2017/02/02 (木) 20:29:44 - フェムト太郎 当方も長期間保存したサンプルを解析した事がないので全くの想像で書きますが、試しに一本融解してRNA抽出を行い、RIN値を調べてみれば良いのではないでしょうか？コントロールとしてセルバンカーに凍結してから数日くらいのPBMCも同様にRNA抽出を行って比べてみればなお良いかと思います。 あとは細胞の生存率もある程度参考になるかと思いました。

(無題) 削除/引用 No.5727-2 - 2017/02/02 (木) 18:40:29 - サンショウウオ 20年には遠く及びませんが、 8年間液体窒素で保存されたHL-60細胞を解凍して培養してウェスタンブロットしたことならあります。

20年保存したPBMCからのRNA抽出 削除/引用 No.5727-1 - 2017/02/02 (木) 12:39:50 - Chip 20年間，セルバンカーで浮遊させた末梢血単核球（PBMCｓ）を液体窒素で保存しています．大規模なコホートサンプルで，遺伝子解析を主な目的に，このPBMCから核酸を抽出したいと考えています． 同様の状況のサンプルで，DNAやRNAを抽出したことのある研究者の方，ご意見やご助言をいただければ幸いです．おおよそ１ｘ１０^6細胞からの抽出になると思われます．DNAは安定しているだろうと楽観的に考えており，ある程度回収できると思っていますが，RNAはほとんど分解されているような気がしています． 回収した核酸は，アレイ解析，SNP解析に利用する予定です． よろしくおねがいします．

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