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(無題) 削除/引用 No.5810-15 - 2017/03/06 (月) 14:32:19 - m 私がやっていたのはCHO細胞ですが、 Lipofectamine3000からTrasIT-CHOに変更したら劇的に生存率が上がりました。 HeLa細胞用もあったと思うので、そちらも一度検討してみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5810-13 - 2017/03/06 (月) 07:01:14 - L3 Trackerさん 情報ありがとうございます。 そうですね、一度カバーグラスを入れずに、プラスチックウェル上でトランスフェクションしてみた方が良さそう（というか必要）ですね。 皆様色々とありがとうございました。順に一つずつ検討していこうかと思います。

(無題) 削除/引用 No.5810-12 - 2017/03/05 (日) 13:18:40 - Tracker HeLaでの経験ではありませんが、、 別の接着細胞で、カバーガラス上の方が細胞が死んで剥がれやすかったという経験はあります。 もう少し具体的には、上皮細胞株にウイルスを感染させた際、プラスチック上で培養しているものよりもカバーガラス上で培養しているものの方が明らかに細胞が早く剥がれました。 (確かマツナミの13mmカバーガラスをエタ滅菌後24Wellに沈めて使っていたと思います) 質問者様と同じく対照の非感染細胞ではすくすくと育つのですが、ある種ストレスに対して脆弱になっている印象でした。 一度プラスチック上でやってみると原因が分かるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5810-11 - 2017/03/05 (日) 11:58:29 - L3 おおさん やはりプラスミド精製は普通の実験台で行いますよね。そもそも大腸菌から取るものですし、最終ステップ以降はいたずらにキャップ開けっ放しで放置とかしないように気をつけてはいますが、一般的に過度の処置は不要のようで安心です。 0さん ラボにあったものを使っているだけで、実はどんなものなのかよく分かっていません。…が、一応トランスフェクションなしでは一切剥がれることなく完全付着したままギチギチになるまで成育を続けるので、トランスフェクション試薬がなければ問題はなさそうかな、と考えています。試薬がガラス表面と反応して…なんてことはなさそうなので、さすがにガラスを不安視する必要はなかったかもしれませんね。 コメントありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5810-10 - 2017/03/05 (日) 11:16:51 - 0 その「コートなしのカバーグラス」というものは親水処理すら施されていないものでしょうか？ HeLaでどうなるかはやったことはありませんが、 親水処理すらされていないものだとしたら剥がれてくる可能性はあると思います

(無題) 削除/引用 No.5810-9 - 2017/03/05 (日) 10:42:54 - おお HeLaは一般的に浮遊してくる細胞もあってそういう性質を見ているのかなぁという気もしています。プラスミド精製は普通の実験台でやっています。何ら無菌とかにするべくように施した環境でやってはいません。

(無題) 削除/引用 No.5810-8 - 2017/03/05 (日) 10:27:24 - L3 Trackerさん ご丁寧に度々ありがとうございます。 やはり、Endo-freeグレードで取ったとはいえ、何らかの要因でプラスミドのクオリティが悪い可能性は十分ありますね。濃度チェックなどで、ベンチ外で普通に開けたりしていましたし…（というかそれ以前に、プラスミド調整は普通にオープンな環境でやっています。しかしこれは、普通はそうでしょうか）。 通常、HeLaでそこまで死ぬわけじゃないという情報がいただけて何よりです。まぁ、あまりにもスタンダードでよく使われている細胞・試薬の組合せなのだから、聞かなくても当然の話だったかもしれませんが…。 試薬はおろし立てのもので注意して扱っているので問題はなさそうなため、やはり一度DNAなしのコントロールで様子を見てみようと思います。 …あ、1つ重要な情報を完全に欠落していました！後で顕微鏡で観察するために、カバーグラス上で細胞を培養しています（24ウェルプレートに、カバーグラスを落としてその上で）。 これが成育・トランスフェクションの毒性に影響を及ぼすことはあり得ますかね…？ちょうどポリリジンコートのカバーグラスを切らしてしまい、HeLaだし大丈夫だろという感じで、コートなしの、オートクレーブだけしたカバーグラスを使っているんですが、関連して、HeLaでも表面コーとした方が良いという情報がありましたらアドバイスいただけると大変幸いです。

(無題) 削除/引用 No.5810-7 - 2017/03/05 (日) 09:51:36 - Tracker 前提として試されていたようですね。 HelaでLF3000の組み合わせはありふれたものだと思いますし、自分もやったことありますが、その細胞密度でmassiveな細胞死が起こった記憶はないです。(培地交換もなし) 前に出ている通りプラスミドや試薬を疑いたくなりますね。 培地交換はベクターと細胞がエピソーマルな組み合わせじゃなければお考えの通りだと思います。 ただし試薬の毒性やらで細胞のタンパク発現に負の影響を与え得ることが十分にあるので、その意味で培地交換を行った方が結果として効率が良くなることはあると思います。

(無題) 削除/引用 No.5810-6 - 2017/03/05 (日) 09:00:25 - L3 Trackerさん ありがとうございます。 培地は、Opti-MEMで混合したミックスを、直接培養中の10％血清培地に加えている形です。なので、この点はほぼ改善の余地がなさそうです。 細胞数は、マニュアルに「トランスフェクション開始時に70-90％」とあるのでそれに従っているのですが、むしろ以前使っていた試薬より遥かに高濃度で始めていいんだなと驚いた記憶があります。その点といただいたアドバイスとを考えると、「高濃度で始めてよい」というより、逆に、ダメージで死ぬのはもう前提で、細胞数を増やして始めてカバーせねばいけない、って感じなんでしょうか。 Lipofectamine 3000って、2000の改良版っぽい名前ですし新しい製品の印象なので、旧世代の試薬より細胞毒性とかもかなり改善されてるんだろうなぁ、と勝手に思ってたんですが、意外にそうでもないんですかね？ 培地交換は、やっていないのでやってみるべきですね。ただ、マニュアルには「2-4日培養」とあるので（これも、異様に長い培養期間なので驚きました）、待てば待つほどトランスフェクション細胞が増えるのかなと思ってずっと交換せず待っていたんですが、やはり毒性も強いですし、培地交換はした方が良さそうですね。 アホな質問かもしれませんが、培地を交換したら、試薬やDNAは洗い流されるので新たにトランスフェクションされる細胞は存在せず、それ以上培養を続けてもトランスフェクション効率を上げるという観点においては無意味ですよね…？ 長文失礼しました、他にご意見ある方いらっしゃいましたら何でもアドバイスいただけると助かります。

(無題) 削除/引用 No.5810-5 - 2017/03/05 (日) 08:36:52 - Tracker ・低血清や無血清培地を使っている場合は通常培養時の10%血清培地とかでやってみる ・細胞数を増やす ・トランスフェクション後6-12時間とかで培地交換 とかは試されましたか？

(無題) 削除/引用 No.5810-4 - 2017/03/05 (日) 08:24:44 - おお あ、HeLaってかいてましたね。失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.5810-3 - 2017/03/05 (日) 07:36:56 - L3 おおさん レスありがとうございます。 細胞は既に記述した通りHelaで、プラスミドはEndotoxin freeをうたっているキットを利用して抽出したものです。また、DNA/RNAオリゴは市販の化学合成品ですが、どうなんでしょう、オリゴには毒性を示す物質がなさそうな気がしますが、こちらはトランスフェクションが上手くいくと毒性を示す可能性もあるので何ともいえません。 DNAなしの、試薬のみのトランスフェクションもコントロールとしてやった方が良さそうですね。ちょっと試薬がもったいない気もして手を出さなかったのですが、現状必要な実験なのでもったいないも何も、やるべき実験でした。 他にも何かいいTIPSがありましたらよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.5810-2 - 2017/03/05 (日) 07:26:06 - おお プラスミドにエンドトキシンなど毒性を示すようなものがある可能性は否定できますか？お使いの細胞が何か開示できますか？

トランスフェクションで細胞が死にすぎる 削除/引用 No.5810-1 - 2017/03/05 (日) 07:15:20 - L3 Lipofectamine 3000でHeLaに対してトランスフェクションを行っているのですが、マニュアルの低濃度条件（24ウェルに、Lipofectamine 3000を0.75 uL）でも、コントロールのGFPプラスミドでさえダメージが大きく、非常に多くの細胞が死んで浮いてしまっています。 実際はDNA/RNAのキメラオリゴを入れたいのですが、これではオリゴの作用（ひょっとしたら細胞毒性があるかもしれない）が見れず、困っています。何かダメージを低減するいい方法なり技・コツ等ありませんでしょうか。

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