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マウス血小板のFACS:消えた血小板 トピック削除
No.5843-TOPIC - 2017/03/16 (木) 19:52:55 - picotaro
5698「マウス全血、精確な量をチューブに移したい」で相談させていただいた者です。その節はありがとうございました。実際にFACSをやってみたところ、FSC/SSCのグラフにそもそも血小板が現れませんでした。赤血球は現れました。プロトコルは

50 µl whole blood
+ 200 µl TBS/heparin (20 units/ml)
+ Tyrode's buffer (cont. 0.138 mg/ml CaCl2)

--> 50 µl of the diluted blood
+ (antibody etc)
+ 1 ml assay diluent

Assay diluentは1%FBS入りのD-PBSを使いました。
何がいけなかったのでしょう?
血小板が凝集してしまったのでしょうか?
抗体などなしにしてとりあえずワイルドタイプマウス1匹でやっても出なかったのです。
ぜひ経験のある先生教えてください。
 
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picotaro 削除/引用
No.5843-8 - 2017/03/20 (月) 14:26:25 - picotaro
Googleに落ちていた個人的に作られたPDFファイルに「0.5 μm~25 μm程度まで解析可能」とあったのですが、確かにマイクロパーティクルの分析の論文もよく見ます。血小板ごときで音を上げていてはいけないですね。チークブリーディングで1μl取るときは、ピペットでprewetしたチップを用いて吸われていますか?その後ビーズと混ぜるときはピペッティングしないのでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.5843-7 - 2017/03/20 (月) 01:46:33 - ものくろ
血小板よりもはるかに小さいマイクロパーティクルなどもフロー解析しますので、マウス血小板が検出限界付近ということはまずないと思います。感度の設定を適切にすれば、十分解析可能です。血小板由来マイクロパーティクルだと、ノイズとの区別に苦労しますが血小板は問題にはなりません。

私はマウス血小板を解析していますが、チークブリーディングで1マイクロ採取したのち、決められた濃度の定量用ビーズとまぜ、フロー解析しています。

(無題) 削除/引用
No.5843-6 - 2017/03/19 (日) 20:41:37 - picotaro
なるほど!確かに、一度目視してみます。大きさは人間の血小板が1-2μm、マウスは0.5μmなので、FACSの検出限界の小ささということになりますね。

参考文献は「Flow-cytometric analysis of mouse platelet function. Methods Mol Biol. 2004;272:255-68m Nieswandt B1, Schulte V, Bergmeier W.」なのですが、そこにはNote3として、「細胞外Cαは血小板活性化におけるインテグリンの親和性制御やその他のプロセスに必要である。結果的には、低値のCαは全血や血小板の保存中の活性化を防ぐか遅延させる。」したがって実験の直前に加えるべき旨記載されております。

アイスは使いませんでした。

ゲートはなるほど、抗体で染めておいてゲートバックすることができるんですね!

今回は全血を用いた血小板数の測定です。顔面の静脈を用いる方法は私もYoutubeで調べていいな、と思いました。しかし今回はチューブに垂らす方法だと精確に50μl測り取ることができず、どこかで一回はピペットで測り取る必要が生じます。また溶液も混ぜないといけません。以前の質問のやりとりでご指導いただいたように、尻尾からヘパリンで濡らしたチップでピペットを用いて吸ってみたのですが、50なかなか吸えず、retroorbitalでやってみたりもしました。(いずれも血小板は出てきませんでした。)

Tyrone's bufferは「Tyrode’s buffer (modified): 134 mM NaCl, 0.34 mM Na2HPO4, 2.9 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, pH 7.0, 5 mM glucose, 0.35% (w/v) bovine serum albumin.」と、グルコース入りです!それがきっとmodifiedの意味なんですね。

とりあえず、定量的なことは置いておいて、まず抗体で染めた状態で機器設定、特にボルテージのチェックをすればよさそうでしょうか。
それで血小板が出て来れば、血小板数の測定や活性化の解析など細かいことを考えられますね。

(無題) 削除/引用
No.5843-5 - 2017/03/17 (金) 04:16:58 - ものくろ
血小板のラボにいます。

マウスの血液はどこから採取していますか?
もっとも侵襲性の低い方法で採取しないと血小板はすぐに活性化します。

チークブリーディングが最適だと思います。その際に最初の一滴目は捨てること、グルコース入りタイロードバッファーを用いることをしています。氷冷厳禁、ピペッティング厳禁ですね。

活性化しているかどうかに関してはCD62P染色でいいでしょう。

ゲートに関してですが、血小板の未染色、CD41で染色したものを用意し、CD41ポジにゲートをして、それをFSCーSSCにゲートバックすればどこに血小板がいるか確認できるでしょう。あとはFSC、SSCのボルテージを適当なものにして、赤血球とマイクロパーティクルの間に血小板がくるように私は調整しています。

(無題) 削除/引用
No.5843-4 - 2017/03/17 (金) 03:39:54 - aso
とりあえず血液を顕微鏡で見て凝集塊があるか確認してはいかがでしょうか。ある程度サンプルの状態を評価できるでしょう。
マウス血液を使える血算計を持っているラボが運良くあれば一度使わせてもらうのも良いでしょう。

サンプル調製の点ではbufferにカルシウムが入っているのが凝集の原因になりうると思います。私はCa-free Tyrode’s bufferを使っています。
また、一般的なFACSと同じようにon iceで染めていると凝集します。

FACSに関しては、ema様もおっしゃられるように血小板のポピュレーションを見つけるまで苦労する事があります。できれば熟練者と一緒に動かすのが一番ですね。

(無題) 削除/引用
No.5843-3 - 2017/03/16 (木) 20:27:59 - picotaro
先輩と手探りですが、血小板をやったことのある人間は皆無です……。今回ボルテージがどうだったかわからないので聞いてみます。添付していただいた文献の図1の血小板のpopulationすら出てこなかった状態です。。。ありがとうございます。

機器のレンジは? 削除/引用
No.5843-2 - 2017/03/16 (木) 20:14:31 - ema
FACSのマシンコントロールは自分で手さぐりですか、それとも先輩ややったことのある技術スタッフとやっていますか?
血小板の領域は小さいので、血球系に慣れている人で分画がうまくわからないというような事がありました。
FSC、SSCのVoltageなどを血球よりもあげる必要性があり、2台あれば1台は小さな分画まで、もう1台は大きな(普通の)分画で早くソートとセッティング仕分けることもあります。
https://www.bdj.co.jp/pdf/66-010-01.pdf

マウス血小板のFACS:消えた血小板 削除/引用
No.5843-1 - 2017/03/16 (木) 19:52:55 - picotaro
5698「マウス全血、精確な量をチューブに移したい」で相談させていただいた者です。その節はありがとうございました。実際にFACSをやってみたところ、FSC/SSCのグラフにそもそも血小板が現れませんでした。赤血球は現れました。プロトコルは

50 µl whole blood
+ 200 µl TBS/heparin (20 units/ml)
+ Tyrode's buffer (cont. 0.138 mg/ml CaCl2)

--> 50 µl of the diluted blood
+ (antibody etc)
+ 1 ml assay diluent

Assay diluentは1%FBS入りのD-PBSを使いました。
何がいけなかったのでしょう?
血小板が凝集してしまったのでしょうか?
抗体などなしにしてとりあえずワイルドタイプマウス1匹でやっても出なかったのです。
ぜひ経験のある先生教えてください。

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