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封入体分離と界面活性剤に関して追加質問 削除/引用 No.5852-7 - 2017/03/30 (木) 21:04:32 - renature ＞おおさん 論文ありがとうございます　参考にします 核酸と膜タンパク質の除去を目的に Tween20を含むバッファーで封入体の洗浄を行ったのですが， （http://www.pssj.jp/archives/protocol/expression/refold_02/refold_02.htmlを参考にしました） 目的のタンパクが洗浄バッファーに溶けてしまっています（SDS-PAGEで確認） やはり仕方のない事なのでしょうか？ ロスを覚悟したほうがいいですか？

(無題) 削除/引用 No.5852-6 - 2017/03/23 (木) 20:39:37 - おお 37°C for 18h For angiotensin, which contains an amino group at its N-terminus, the relative ratio of carbamylation is 0.20 and 0.31 in PB buffer and 0.2M Tris-HCl buffer, respectively https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4072244/ こんなのがありました。上記の条件で２０％ぐらいが就職されてしまうんですかねぇ、、、ちょっと計算方法を確認してませんけど。NH4HCO3 bufferがそれを防げるって書いてますね。

返信ありがとうございます 削除/引用 No.5852-5 - 2017/03/23 (木) 18:28:35 - renature S11さん >なにそれ。初めて聞きました。 尿素からできたシアン酸が修飾をするときがあるみたいです http://www.pssj.jp/archives/protocol/expression/refold_01/refold_01.html 774Rさん >不溶画分を集めればそこそこの純度 大腸菌の破砕の時にいきなり可溶化するのでなく， 可溶性タンパクや膜タンパクを除去するという意味で大丈夫でしょうか？ おおさん >神経質なひとは尿素使うのさえ避けますね やはりそうですか・・・ 私もグアニジン塩酸塩を最初は使おうと思いましたが， 尿素よりもコストがかかり過ぎるので条件検討の候補から外しています・・・・

(無題) 削除/引用 No.5852-4 - 2017/03/23 (木) 08:07:50 - おお >�A尿素可溶化後にサンプルはどれくらい保存を行ってよいのか？ 神経質なひとは尿素使うのさえ避けますね。。。どの程度影響があるかどうかはわかりませんけど、長期保存はしたくないですね。蛋白用の尿素を含むバッファーは用時調製するほうがいいという人もいますから、やはり数日以内に尿素を使う過程を終わりにしてしまいたい気がします（あくまでも感覚的です）。温度が上がるとてきめんに良くないです。

(無題) 削除/引用 No.5852-3 - 2017/03/22 (水) 19:50:43 - 774R 精製に関しては、不溶画分を集めればそこそこの純度が得られるので、その程度で良いと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.5852-2 - 2017/03/22 (水) 19:37:11 - s11 1 はい 2 可溶化すればしばらくは問題ないと思いますよ。 なにそれ。初めて聞きました。 3 スモールスケールでいいでしょう。

リフォールディング条件検討に関して　尿素可溶化後など 削除/引用 No.5852-1 - 2017/03/22 (水) 13:47:46 - renature 大腸菌の不溶性分画由来のタンパク質のリフォールディング条件を検討しようと思います。 バッファー種類，イオン強度，還元剤条件，温度を調べていくことは知っております。RefoldDBで先行研究がない事も確認しました。透析法で行っていく予定です。 今困っているのが， �@精製したタンパクで行うべきなのか？単一に精製しておくことはこだわるべきなのか？（した方がbetterだと思いますが・・・） �A尿素可溶化後にサンプルはどれくらい保存を行ってよいのか？ タンパクへのシアン化修飾には気を付けておくべきなのか？ �B条件を多く調べるためにはどう工夫をすればいいのか？ ご助言のほどお願いします。

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