BioTechnicalフォーラム [PCRでのネガコンの発現]

PCRでのネガコンの発現

No.5875-TOPIC - 2017/04/01 (土) 15:34:07 - EiiMii

KOマウスのタイピングを行っています。
特定のプライマ―を使った際、必ずネガコンが発現します。

バッファー、ｄNTP、MIｌｌQ水、プライマ―、酵素をmixした状態で
8連のPCRチューブに分注し、それから各々のDNAを分注します。

・試薬をすべて交換（プライマーも希釈し直し）しても変わりません。
・PCRの機械は問題ないです。
・サンプルにも問題ありません。
・別の人が同じ試薬を用いて行うとネガコンは出ません。
・酵素の量には問題はありません。
・水を取る際にもフィルター付きチップを使っています。
・ピペットマンも洗浄したため、問題ありません。
・プライマー自体が汚染されるのを避けるためにプライマー原液（100μM）のものはかならずフィルター付きのチップを使用して希釈用原液をとっています。

私の技術的問題だとは思うのですが、もう原因の心当たりがなく、困っています。

何か思い当たる事がありましたら、ご教授ください。

※泳動は同じ部屋で行っていますが、実験台は離れています。
　泳動用のピペットマンは専用のものを使っていて、PCRには使用していません。
　泳動を行った後でPCRの作業は行っていません。
　
　

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No.5875-5 - 2017/04/03 (月) 16:01:18 - AP

>特定のプライマ―を使った際、必ずネガコンが発現します。

ネガコンってなにをやっているのかな？（PCR陽性のことを発現とは言わないよ）
鋳型DNAなしでも増えるってことでしょうか、増えないはずのalleleのDNAでも増えるってことでしょうか？

genotypingのストラテジーはどういうの？
例えば、alleleによって全く存在しない配列をプライマーに選んでるのか、SNPを利用してプライマーの3'配列の違いでタイピングするのか？

後者の場合、
>バッファー、ｄNTP、MIｌｌQ水、プライマ―、酵素をmixした状態で
こういうやり方すると、酵素の種類によっては遊離プライマーの3'側がexo活性で削れてalleleを区別しなくなります。削れるか削れないか、どのくらい削れるかは、スキルの違いがでます（もたつく、温度管理がわるいなど）。

(無題)

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No.5875-4 - 2017/04/03 (月) 14:00:29 - hana

同じprimerのセットで同じサイクルを回しても他の人は出ないんですよね？

上手くいかない時は何をやってもダメでどんどんはまり込んでいく……というの
は私もよくなりますが。

a) PCRのサイクルを減らす→回しすぎると変なものを引っかけてくることがある
b) primer変更→同じのを買い替えるんじゃなくて、出来れば違う配列のもの

たぶんprimer変えちゃうのが確実というか、実験としてはいいのかと。
自分が汚染されてるんだな、くらいのつもりで諦めるようにしています。

しばらくほっといて久々にやると上手くいくってのはよくあることです。

(無題)

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No.5875-3 - 2017/04/01 (土) 16:59:42 - おお

一つだけアドバイスできるとすると、コンタミはないだろうと思っているけど、完全に配慮できないところで困っている部分があると思いますが、サンプルを入れずにPCRをしたりしましたでしょうか。

(無題)

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No.5875-2 - 2017/04/01 (土) 16:51:38 - おお

どんなに細かく記載していただいても、周りの状況がわかった人には叶いませんので、そういう人からアドバイスをもらったり、実際やっているところを見たり、並行して横でやったりした方がいいと思います。

PCRでのネガコンの発現

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No.5875-1 - 2017/04/01 (土) 15:34:07 - EiiMii

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