BioTechnicalフォーラム [顕微鏡の長時間観察のコツについて]

顕微鏡の長時間観察のコツについて

No.5885-TOPIC - 2017/04/05 (水) 19:37:32 - コーボ

私は現在顕微鏡を用いて酵母細胞を長時間(1～3hr程)観察する実験を行っているのですが、時間が立つにつれてカバーガラスとスライドガラスの間に空気が混入してしまってサンプルがずれてしまい、観察がうまくいきません。

方法としては、培養した酵母をエッペンに取ってソニーケーション後、遠心し、少量の液体培地に溶かしたものを30℃のサーマルプレート上のスライドガラスに4μl乗せ、気泡が入らないようにカバーガラスをかけて、カバーガラスの周りをマニキュアで固定して観察するという形です。

どなたかこのようにすれば時間がたっても気泡が発生しないというような方法をご存じであればご教授お願い申し上げます
　

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No.5885-9 - 2017/04/10 (月) 15:18:24 - コーボ

皆さんご意見ありがとうございました。

30%グリセロール培地で試したところ安定して観察できそうなのでこのまま挑戦してみたいと思います。

メチルセルロースはグリセロールでうまくいかなかった場合に試してみようと思います。

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No.5885-8 - 2017/04/07 (金) 22:03:09 - おお

うまくいくかわかりませんが、シリンジにいくらか吸い取って、シリンジの先をゴム栓などに押し当てて引いて陰圧にすると溶け込んでいる気体がある程度抜けます。

(無題)

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No.5885-7 - 2017/04/07 (金) 20:49:11 - mon

以下は浮遊培養細胞用のコロニーピック用培地・凍結保存液のレシピですが、1~0.1%メチルセルロースで使いよい濃度にすればよいと思います。

メチルセルロースは4000cPのものを用いています（和光純薬048-21985）。滅菌法は以下の通りです。１％メチルセルロース原液をＤＭＥＭに100mL作ることを想定しています。
１．１ｇのメチルセルロース粉末とスターラーバーを滅菌可能な100mL瓶にいれ、オートクレーブする。（溶かしてから滅菌することはできませんので注意してください）
２．冷えたら、滅菌した培地を100ｍｌ加え、密封し、冷蔵庫中でスターラー上で攪拌する。溶解まで２日ほどかかるかもしれません。また溶解しても、顕微鏡でみるともやもやしたものが見えますが、気にしないでください。
３．これをストック溶液とし、冷蔵庫に保存する。
４．コロニーピック用培地はストック溶液を増殖培地で5~10倍希釈する。細胞凍結保存液は最終濃度8~10%DMSO、0.1％メチルセルロースとなるように培地に混合する。

(無題)

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No.5885-6 - 2017/04/07 (金) 18:03:39 - コーボ

> 粘度を上げるためなら、グリセロールよりメチルセルロースの方が代謝に影響しない

そうなんですか。よろしければどれくらいの濃度なのかも教えていただけますか？
グリセロールと同じでも粘度は変わらないのでしょうか？

(無題)

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No.5885-5 - 2017/04/06 (木) 20:20:50 - mon

粘度を上げるためなら、グリセロールよりメチルセルロースの方が代謝に影響しないですよ。気泡の発生を抑えられるかは不明です。

(無題)

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No.5885-4 - 2017/04/06 (木) 19:42:00 - コーボ

貴重なご意見有難うございます。

液体培地を超音波処理して何度か観察しましたが、空気が入ってしまいました…

グリセロールを最終濃度15%にした培地で懸濁ところうまくいきそうなのでやってみようと思います。

その他にも何かご存じの方がいらっしゃいましたらよろしくお願いします。