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(無題) 削除/引用 No.5918-14 - 2017/04/19 (水) 15:04:11 - AP >私の言ってるバンドはcccよりかなり下に出ます。プラスミドのサイズにもよりますが、TAEアガロースゲルでおおよそ半分〜2/3くらいのサイズ。 それこそ出たことないわあ

(無題) 削除/引用 No.5918-13 - 2017/04/19 (水) 14:50:31 - CsCl 追加 私の言ってるバンドはcccよりかなり下に出ます。プラスミドのサイズにもよりますが、TAEアガロースゲルでおおよそ半分〜2/3くらいのサイズ。

(無題) 削除/引用 No.5918-12 - 2017/04/19 (水) 14:34:32 - CsCl Mung Beanヌクレアーゼ処理で消えるのでssDNAだと判断していました。

(無題) 削除/引用 No.5918-11 - 2017/04/19 (水) 13:57:13 - AP >alkali-SDS法でプラスミド調製して直鎖状DNAのバンドが見えるほど出ますか？ It depends.(誰かのマネ） 見える場合はOCのやや下でone-cutのサイズと一致。one-cutするとcccもOCもこのサイズに収斂する。 >むしろalkali処理が効きすぎて、nicked formが変性した一本鎖が出ることはありますが。 どうしてそのformだと判断できますか？ アルカリ法でよく問題になるのはcccの部分変性でプラスミド全体の塩基対のレジストリが狂い制限酵素が認識しなくなるトラブル。電気泳動では本来のcccのわずかに下にでる。

(無題) 削除/引用 No.5918-10 - 2017/04/19 (水) 13:17:59 - toto > RNaseは安定性がある酵素だから > アルカリ処理，PCI処理をしても活性が残って > 実験を進めていくうちにRNA分解をしてくれるということでいいでしょうか・・・ 私もこれが不思議でならなかったですが、いくら何でも0.1N NaOH/1%SDSではRNaseも変性してこのときは失活します。ただ、中和してSDSがカリウム塩となって除かれたときにrefoldingするようです。還元してないので、RNaseのS-Sが残るので、元に戻りやすいのでしょう。それにしてもよくこんな簡便技を見つけたなと思いましたが、きっと、テクニシャンの人が間違えてRNaseを最初から加えておいたらRNAが分解されてた、というあたりではないかとにらんでますが。

(無題) 削除/引用 No.5918-9 - 2017/04/19 (水) 11:41:26 - CsCl alkali-SDS法でプラスミド調製して直鎖状DNAのバンドが見えるほど出ますか？ むしろalkali処理が効きすぎて、nicked formが変性した一本鎖が出ることはありますが。

(無題) 削除/引用 No.5918-8 - 2017/04/19 (水) 11:13:16 - AP RNAが残っているのはRNaseが失活してきているからかも。ちゃんと効いていれば見えなくなるくらいになるのが普通です。 >RNaseは安定性がある酵素だから アルカリ処理，PCI処理をしても活性が残って 実験を進めていくうちにRNA分解をしてくれるということでいいでしょうか・・・ 市販のキットでは利便性のためSoln 1に入れるようになっています。 アルカリSDS処理（Soln 2)、中和塩析（Soln 3）の間に効かせるようにデザインされています。RNaseが頑丈だからそれでも効くということでいいですが、キットのレシピでは通常よりだいぶ濃い濃度で入れてるみたいなので、やはり比活性は下がるんでしょう。古典的には、また今でも私は、精製したプラスミドの沈殿を溶解するTEにRNaseを入れるのが常法としています。 塩析のあとでカラム精製やPCI抽出をするならその時点でRNaseは除去されることになっています。塩析のあと直接アルコール沈殿してもそれなりにきれいなプラスミドは取れます。その場合は一応RNase除去の処理はかませていないことになりますけど。 >抽出したプラスミドを電気泳動にかけたときはプラスミドのバンドは三本見えて問題ないですか？（コイル，環状，一本鎖） それで普通です。 それぞれccc (covalently closed circular, あるいはSC, super coil、閉環状)、OC (Open circular、開環状)、Linear（線形、線状）といいます。一本鎖という言い方はおかしいですね（DNAは二本鎖だし、Linearを一本鎖というならcccだってOCだって一本鎖）。 傷物が増えるに従ってcccの割合が減ってOCやLinearが増えてきますが。 プラスミドの泳動像に３つバンドが見えることから古くは、ccc, OC, Linearにあたる三態をそれぞれform I, form II, form IIIなんて呼んでいました。

ありがとうございます　勉強不足でした 削除/引用 No.5918-7 - 2017/04/19 (水) 09:59:09 - プラスミド抽出 Solution IにRNaseを入れる方法なんですが， RNaseは安定性がある酵素だから アルカリ処理，PCI処理をしても活性が残って 実験を進めていくうちにRNA分解をしてくれるということでいいでしょうか・・・ 初歩的なことなんですが， 抽出したプラスミドを電気泳動にかけたときはプラスミドのバンドは三本見えて問題ないですか？（コイル，環状，一本鎖） >中年さん やはり残るものなんですよね。 プロトコルが内部で混在していて・・・ Solution IにRNaseを入れるやり方もみられて， その方法と混在してしまったかと思います。 （自分は入れていませんでした） スケールの話なんですが， 多分ミニプレップでちまちまと少量回収していく点で揉めたんじゃないかと思います。先輩は小さい実験系をされて，先生はある程度大きい実験系を組む方なので・・ 確かに，揉めることではないと思います・・・・ 私事ですみません >APさん クローニングの本は見ていませんでし。 勉強不足でした。ご指摘ありがとうございます。 >おおさん やっぱりRNAは残りますよね。 もしかしたらテクニカルのせいでRNAが残っているのかと，不安でした。 安心しました。

(無題) 削除/引用 No.5918-6 - 2017/04/18 (火) 22:29:31 - おお >変法でSolution IにRNaseAを予め入れておく 実は質問者はこれをやっていて、それでも残ったときはRNase処理が最後の段階で必要ということを言っているのか、質問者が聞いた方法が変法の対処方法だけど、実際はSol IにRNaseを入れてないとか、、、何れにせよRNaseをどこかのステップで使わないと確実にRNAは混じってきます。

(無題) 削除/引用 No.5918-5 - 2017/04/18 (火) 22:18:52 - AP 精製したプラスミドを溶解するTEに10 ug/mL程度のRNaseを入れるというのもよくやる方法。これまた多くの用途ではRNaseが共存していても問題ない。除きたいときはさらにPCI抽出/EtOH pptをする。

(無題) 削除/引用 No.5918-4 - 2017/04/18 (火) 22:12:42 - AP mini, midi, maxiって精製スケールだけの違いでやってることはおなじ。この場合、alkali/SDS とかalkali lysisと呼ばれる手法だね。ミニはエッペンチューブ一本でできるスケール。他にもboiling methodなんかもあるし、この方法でも色々な精製スケールがあり得る。Molecular Cloningのようなちゃんとした成書を見れば一通り書いてある。 RNaseがちゃんと効いていれば電気泳動で見えなくなるくらいにはRNAは分解するのが普通。それでも残っていたり見えない程度に分解してるけど残った小断片をちゃんと除きたいときは、PEG/NaCl沈殿またはPEG/MgClをする。 RNAが残っていても問題ない用途も多いので、何が何でもRNAを除ねばならないということでもない。

(無題) 削除/引用 No.5918-3 - 2017/04/18 (火) 22:06:03 - 中年 すみません。 ×調整 ○調製

(無題) 削除/引用 No.5918-2 - 2017/04/18 (火) 22:04:34 - 中年 �@ いわゆるアルカリ法であれば、RNAのスメアは当然残ります。残るというより、それがEtBrで染色されるモノとしてはメジャーです。変法でSolution IにRNaseAを予め入れておく方法もあって、その場合は最終産物にRNAのバンドはほとんど見えないことも普通にあるでしょうね。 �A ミニプレップは単なるスケールの話で、よく使われる用語としては、1.5 mLサンプルチューブ一杯のO/Nカルチャーからスタートするプラスミド調整をミニプレップと呼びます。もちろん、もっと大きいスケール、例えば50 mLや1 Lからスタートして、より大量のプラスミドを調製することも可能で、midi-prepやmaxi-prepなどと言うこともありますが、こちらは人によってスケール感が違うこともあるでしょう（だからといって、そんなことで喧嘩はしないのが普通）。

アルカリSDS法/PCI処理とRNA，ミニプレップについて 削除/引用 No.5918-1 - 2017/04/18 (火) 21:42:54 - プラスミド抽出 �@プラスミド抽出をアルカリSDS法/PCI処理にて行っています。 具体的な方法は研究室歴代の方法を用いています。 そのプロトコル内で「RNAが残っていればRNase処理をする」 といった記載があります。 電気泳動でプラスミドよりも下に出てくるスメアなバンドをRNAであるとみて 処理しています。（実際はrRNAらしいですけど） 実験のたびにRNAがみられます。 正直，「うまくいったら」RNAが残らない原理が分かりません。 プロトコルのミスと見たほうがいいでしょうか？ �A上記のプロトコルはミニプレップの系（？）らしいんですが， ミニプレップ以外の系があるのかがよくわかりません。 （辞書的な質問ですみません，言葉の意味自体がわかりません） 上の先輩と教員がミニプレップかどうかで揉めたことがあるらしいんですが， どうして揉めてしまったかがわかりません。 （本人たちに聞ける雰囲気でないので・・・・すみません）

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