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(無題) 削除/引用 No.5937-7 - 2017/04/30 (日) 15:34:40 - ぺーぺー ○○を転写に使うのが慣例的に言われていますが、確かにPCR産物の○○を鋳型と ごめんなさい、○○の部分が文字化けしているのでちょっと分からなかったのですが、PCRで増やすと質量あたりのコピー数が増えるというメリットもあります。

たすかりました！ 削除/引用 No.5937-6 - 2017/04/29 (土) 19:22:05 - いんしつマン 皆さん、力強いコメントありがとうございました。 思い切って今回の変なプローブは処分して、ちゃんと切ってRun-Off転写を行いました。 PCRでの鋳型増幅はオプションとして覚えておきます。 1µgを転写に使うのが慣例的に言われていますが、確かにPCR産物の1µgを鋳型とするなら滅茶苦茶とれそうですね。 重ねて、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5937-5 - 2017/04/28 (金) 23:05:37 - ぺーぺー やり直しに一票、ついでに（不都合がなければ）鋳型をPCRで増やすに一票です。 拝見する限り、今回の産物にこだわる意味はないと思います。 （動物を使っているのであれば）実験動物のReductionという視点からも。

(無題) 削除/引用 No.5937-4 - 2017/04/26 (水) 11:26:10 - AP 話はずれるが、制限酵素で線形化するより、PCRで鋳型を増やすのがいいんじゃないか。そのほうがup-to-dateだと思うが。 もうプラスミドが出来ているなら、M13系ユニヴァーサルプライマーかT7/T3/SP6 プロモータプライマーで増やせば、プロモータ配列付きの鋳型がたんととれる。ベクターに入れていなくてもプロモータ配列を付加したプライマーでPCRをかければいい。 PCR産物は末端が3'突出あるいは平滑なのでIVTの鋳型にもお誂え向け。 精製プラスミドを鋳型にするより、不純物のもちこみ（RNaseとか大腸菌由来のリポ多糖とか）がはるかに少なくなるし、制限酵素で切れないプラスミドが残るといったトラブルもない。 ベクター由来の配列をぶら下げているプローブは、特別な理由がないかぎり却下ですな。 ・余計な配列がついているということは、ミスマッチがそれだけあるということと同様、ハイブリの安定性を下げる可能性がある。 ・プローブが長いほど浸透速度やハイブリのカイネティクスが低くなるので、わざわざ余計な配列で長くするのは不合理。 ・プローブ本体ですらノンスペシフィックなハイブリや吸着が起こってバックグラウンドの問題を生じることがあるくらいなのに、プローブとして役立たない標識RNAを余計に加えるというのは不合理。 まあ、理屈はともかく、やってみたら出来ましたってことはままあるだろうけれど、好んでやるこっちゃない。

(無題) 削除/引用 No.5937-2 - 2017/04/26 (水) 11:01:28 - seventh 仮にシグナルが出たとしてそれが特異的であるか疑わしいので、おこなった実験全てに疑義がでてくると思います。 欠失ミュータントなどでネガコン、ポジコン等が用意できるなら使えなくも無いかもしれませんが、作り直す手間と費用を惜しむためにそれより大きな問題の可能性を残すのは得策ではないと思います。

in situ ハイブリのプローブ合成の際につかう制限酵素 削除/引用 No.5937-1 - 2017/04/25 (火) 21:11:22 - いんしつマン いつも大変お世話になっております。 in situ ハイブリダイゼーションのRNAプローブ作成を久しぶりに行うことになり pGEM-T easy vectorに目的配列をクロ―ニングしてリニアライズしていざ転写！と作業をしておりました。 この際、確認もせず、マルチクローニングサイトから離れたところにある制限酵素（具体的にはScaI）で切って転写に持っていけば楽ちんじゃないか！ と、ScaIで切ってそのまま転写に行ってしまいました。 成書には、プローブ配列直下の制限酵素で切るなどの文言があり、このままでは関係のないpGEM-Tの配列を持ったプローブができてしまう、と焦っております プローブに使う配列は短く、pGEM-T由来の配列がプローブに含まれてしまうことを懸念しております。 プローブの長さは、mRNAの細胞内での挙動を見るためExon間やイントロンのプローブを設計しており、60bp〜130bpくらいの設計です。 このようなやり方でもいけるかどうか、やってみたらできたよ、と言う方、なにか知見がある方、やめとけと言う方、いらっしゃったらご意見コメントお願いいたします。 条件によってはLNAを使うこともラボ内ではすでに上がっております。 いんしつマン

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