全2件 ( 1 〜 2 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.5941-2 - 2017/04/27 (木) 15:13:29 - mon １コピー/ゲノムのBACでしょうか。薬剤耐性遺伝子も導入するので、「一塩基置換」+@ですね。。 大腸菌ゲノムへの相同組換え実験（薬剤耐性遺伝子による遺伝子破壊）を行った経験が有ります。 相同部位外側からのPCR/シークエンス確認の手間を考えて50~200bpの相同部位を用いましたが、長いほど効率が良いようです。 相同部位外側および薬剤耐性遺伝子内のプライマーによるPCRで検討したところ、薬剤耐性クローンのうち相同組換えが生じたクローンは1/20~1/5ほどでしたが、他の部位にも挿入されていたクローンもありましたので、BACならRE-Mapingやサザンブロットでの確認が必要かもしれません。 なお、DH10B株の場合得られる薬剤耐性クローンの数は、通常のplasmidへのサブクローニング(いわゆるligation液）の場合の1/100-1/1000でした。そのため導入するDNA量は多めが良いですが何パターンか試して、コロニー数が少ないから選んだ方が複数箇所挿入クローンが少ないと思います。 薬剤耐性遺伝子を併用するなら100bp~300bpをお薦めします。反復配列は避けた方が良いでしょう。 組換え酵素(Red/ET)を利用するなら50bpでも効率がかなり良いようです。

相同組換え 削除/引用 No.5941-1 - 2017/04/27 (木) 11:07:24 - 組換えマシン 全長200kbの環状DNAのある塩基の一塩基置換を行う予定です。置換方法大腸菌内での相同組換えを予定しております。その際、相同配列の長さはどのくらいに設定するべきでしょうか。文献上では50-100bpや1000bpなど様々です。ちなみに、大腸菌内での薬剤選択を行うため、相同配列内部の塩基数は約1000bpです。したがって、【相同配列-1000bp-相同配列】このカセットを大腸菌に導入する予定です。 コメント宜しくお願いします。

全2件 ( 1 〜 2 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---