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(無題) 削除/引用 No.5958-8 - 2017/05/05 (金) 16:36:01 - おすし おおさん 丁寧にありがとうございます。 まず手を動かしてみようとおもいます。 とりあえず、ミセルのままゲル濾過をしてみます。 何かあったらここで報告出来たらと思います

(無題) 削除/引用 No.5958-7 - 2017/05/04 (木) 02:35:32 - おお 膜を溶解するときは比較的高い濃度の界面活性剤を使いますが（溶解する膜の量などと実際の容量で決まるでしょうけどTritonX100とかだと１％以上とか）、いちど可溶化してしまえばそんなに高い濃度は必要ないです。目的の蛋白を高い濃度の界面活性剤で可溶化してイオン交換に吸着して０．１％以下で溶出することもまあまああります（それで目的のものが非特異に吸着しなければ）。わたしはたしか０．０３％とか使ってたことがあったと。。。 蛋白はミセルの中に入っているでしょうけど、サイズ的にはある程度納得の行くところに出てくることはよくあります。蛋白につく界面活性剤のミセルの状態が単独の場合とかなり違う場合もあるかもしれません。どうしても気になるなら限界ミセル濃度以下という手はありますが、０．０１％以下だったかな、非常に低い濃度になるかと。それで蛋白があぐらなかったり、カラムに疎水的に吸着しなければそれでもいいでしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.5958-6 - 2017/05/03 (水) 19:35:32 - おすし 未同定のタンパク質でいまのところ、界面活性剤で溶解し、活性があることしか分かっていない現状です。 貫通型だと、界面活性剤は必須なのですね。ありがとうございます。 ゲル濾過でやってみようと考えていますが やはり分子サイズはtritonx-100がミセル形成した際の分子量であると考えるべきなのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5958-5 - 2017/05/03 (水) 17:48:07 - nnn 確認したいのですが、"膜に局在する"というのは膜貫通型の膜タンパク質ということで良いですよね？それだと、界面活性剤は必須だと思います。特殊な脂質を用いて代用することもあるようですが、一般的には界面活性剤を用います。ゲルろ過でもイオン交換でも、使用する全てのbufferにcmc以上の界面活性剤を加えて精製します。

(無題) 削除/引用 No.5958-4 - 2017/05/03 (水) 12:39:54 - おすし >膜タンパク質から界面活性剤を除いたら、不溶性になりますよ。 試しに界面活性剤を含まないbufferで希釈したらわかります。 やはり、取り除くのは難しいのですね。 そうするとやはり界面活性剤に溶けている状態で精製しなければならないということなのですね。

(無題) 削除/引用 No.5958-3 - 2017/05/03 (水) 12:29:31 - おすし >カラムは何を使っても良いと思いますよ。 ゲルろ過でもイオン交換でも。 ゲルろ過で希釈されてしまうと思うのですが、 界面活性剤に溶けている膜タンパク質を濃縮するのは難しいのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5958-2 - 2017/05/03 (水) 12:25:32 - nnn カラムは何を使っても良いと思いますよ。 ゲルろ過でもイオン交換でも。 >界面活性剤を取り除いた場合の活性の有無確認したいのですが 膜タンパク質から界面活性剤を除いたら、不溶性になりますよ。 試しに界面活性剤を含まないbufferで希釈したらわかります。

膜タンパク質精製 削除/引用 No.5958-1 - 2017/05/03 (水) 11:06:54 - おすし グラム陽性細菌の膜に局在する酵素を活性を維持したまま精製しようとしています。 今のところ超音波破砕後、遠心分離して得られた細胞に1%tritonX-100を加えることで可溶化させることが出来、活性を維持していることを確認することが出来ました。 このあと、さらなる精製をしようと試みているのですが やはり活性を維持したままとなるとゲルろ過でしょうか。他に最適な方法があったら教えてほしいです。 また、界面活性剤を取り除いた場合の活性の有無確認したいのですが どのような方法が良いと思われますか？経験ある方いらっしゃったら教えていただきたいです。

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