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通常の蛍光顕微鏡での各蛍光画像のフォーカスのズレについて トピック削除
No.5967-TOPIC - 2017/05/11 (木) 03:52:33 - 免疫染色初心者
初めて書き込みいたします。培養細胞の免疫染色を始めたばかりの者で、周りにあまり経験者がいないので、ここで質問させてください。

今、細胞質にい発現するGFP、小胞体マーカーPDI、トランスゴルジ網TGN46、DAPIの4色を用いたエピ蛍光顕微鏡での画像取得を試みています。倍率はx60です。

当たり前のことかもしれませんが、GFP（目的のプラスミドがトランスフェクトされたことを保証するためのGFPです。）陽性の細胞をまず目視で探し、その細胞での各オルガネラマーカーを見ていますが、GFPでフォーカスを合わせると、他のマーカーでは必ずしも最適なフォーカスになっていないことが多々あります。

そこでみなさまは、各チャンネルでフォーカスを合わせて画像取得および重ね合わせをされますか？
それとも、何か一つのチャンネルでフォーカスを固定して、残りのチェンネルはたとえフォーカスがずれていても気にせず画像取得および重ね合わせをされますか？

ベストな選択はコンフォーカルなのでしょうが、私のところには無く、まずはエピで良さげな結果が出たら共焦点を考えることになっています。または、エピ画像でもデコンボリューションという操作をすればいいのかもしれませんが、そのようなソフトウェアも所持しておらず、というところで、みなさまのご意見を参考にさせていただけないかと思い、質問いたしました。どうか、よろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.5967-4 - 2017/05/12 (金) 08:47:25 - まるやま
confocalでも、高倍率になると、細胞膜、細胞質、核などそれぞれのためのベストなフォーカスが異なります。焦点深度が浅いから仕方がないです。写真機で、望遠レンズの焦点深度が浅いことと同じ原理です。

ただ、confocalでは、どうしても高倍率で撮影する必要があるなら、メインのターゲットに焦点をあわせて、他の色は、レーザー強度やCCDの感度をあげて、むりくり撮影するという手はあります。

そもそも、エピ蛍光顕微鏡でできる仕事なのですか？

(無題) 削除/引用
No.5967-3 - 2017/05/11 (木) 10:43:40 - 独り言
蛍光色素は何をつかってますか？
630nmぐらいのFar red領域だと対物レンズの性能にもよりますが色収差が完璧でないので、同じものを染めてもフォーカスがずれます。（ためしに同じタンパクを緑とFar redで染めてみると良いと思う）
色収差が問題であれば、コンフォーカルにしても解決しません。

色収差の参考
http://www.olympus-lifescience.com/ja/support/learn/04/016/

大体60倍のレンズはFar red領域の色収差はちゃんとしたもの使っていところは少ないと思う。たぶん100倍のレンズなら色収差がFar redでもできるものがあるので、自分が使っている対物レンズの性能をしらべてみると良いです。

(無題) 削除/引用
No.5967-2 - 2017/05/11 (木) 06:10:55 - おお
小胞体マーカーPDIが一番みたいのならそれにフォーカスを合わせてあとはそれに合わすとか言うのが通常ではないでしょうか。トランスゴルジ網TGN46にフォーカスがあった絵もほしいならそれに合わせた違うセットも作ればいいのではないか。GFPなんて光っていることだけで何らそれ以外に意味がないのでは。どうしてもというならGFPに限っては一番見えのいいフォーカスで取っておいて他の画像とmergeせずに別画像として横に示しておけばいいのでは。

そもそもGFPを含め３色マージしても色の組み合わせが複雑になり、絵を見てもどこでどれとどれが重なっているか判断しにくくなるし、実際そういう絵を見ることがあるけどそれ見てちゃんとデーターを読み取っているんだろうか不思議に思う。

通常の蛍光顕微鏡での各蛍光画像のフォーカスのズレについて 削除/引用
No.5967-1 - 2017/05/11 (木) 03:52:33 - 免疫染色初心者
初めて書き込みいたします。培養細胞の免疫染色を始めたばかりの者で、周りにあまり経験者がいないので、ここで質問させてください。

今、細胞質にい発現するGFP、小胞体マーカーPDI、トランスゴルジ網TGN46、DAPIの4色を用いたエピ蛍光顕微鏡での画像取得を試みています。倍率はx60です。

当たり前のことかもしれませんが、GFP（目的のプラスミドがトランスフェクトされたことを保証するためのGFPです。）陽性の細胞をまず目視で探し、その細胞での各オルガネラマーカーを見ていますが、GFPでフォーカスを合わせると、他のマーカーでは必ずしも最適なフォーカスになっていないことが多々あります。

そこでみなさまは、各チャンネルでフォーカスを合わせて画像取得および重ね合わせをされますか？
それとも、何か一つのチャンネルでフォーカスを固定して、残りのチェンネルはたとえフォーカスがずれていても気にせず画像取得および重ね合わせをされますか？

ベストな選択はコンフォーカルなのでしょうが、私のところには無く、まずはエピで良さげな結果が出たら共焦点を考えることになっています。または、エピ画像でもデコンボリューションという操作をすればいいのかもしれませんが、そのようなソフトウェアも所持しておらず、というところで、みなさまのご意見を参考にさせていただけないかと思い、質問いたしました。どうか、よろしくお願いいたします。
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