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(無題) 削除/引用 No.5971-3 - 2017/05/15 (月) 04:44:08 - おお 検出レベルの違いはあるんだろうけど、人正常線維芽細胞でエンドのp５３は特異抗体で検出できてましたので（ガンなどで見つかる変異型に比べてかなり低いですけど）、分解されてしまっていて見れないほどと言う感触はないです。 抗His−Tag抗体は特異性、検出感度の観点から、特にマンマルなどの細胞では扱いにくい抗体です。p５３特異的な抗体など探してみるといいかもしれません。ウイルスと細胞の相性はよくわかりませんが、その点も含めて感染効率の確認も必要かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5971-2 - 2017/05/15 (月) 01:59:35 - TK-1 1) ires GFPなどの発現レポーターを入れることで少なくとも感染効率は検討できる。 2)細胞を回収する前に数時間程度,MG132などで分解を阻害する。 3)MDM２で分解されない変異体があればそれを使う。

p53の強制発現 削除/引用 No.5971-1 - 2017/05/14 (日) 18:41:09 - はじ 現在大学院生で、犬の腫瘍の研究をしています。 その過程で、犬の腫瘍細胞株に野生型および変異型（ナンセンス変異）のp53遺伝子を導入して機能変化の解析を試みています。両遺伝子ともN末端にHisタグを付加し、レトロウィルスを用いて安定発現株を取得する予定です。 まず遺伝子の導入がうまくいっているか、また変異型がタンパクとして発現するのかを検討するため、抗Hisタグ抗体を用いてウェスタンブロットで検出しました。すると、野生型・変異型ともバンドが認められませんでした。野生型を導入すると細胞の増殖が遅くなり徐々に死んでいく現象は観察できているので、p53は機能していると思うのですが。。 p53の強制発現とウェスタンブロットによる検出を行った方で、同じような経験をお持ちの方はいらっしゃいますでしょうか？ また自分は細胞内でp53がMDM2によって素早く分解されているためにウェスタンンで検出できていないと考察していますが、妥当でしょうか？

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