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細胞が死んでしまう(フィーダーフリー化の未分化iPS細胞) トピック削除
No.5978-TOPIC - 2017/05/19 (金) 14:48:53 - キンパチ
細胞培養歴10年程の培養作業者です。

数年前からヒトiPS細胞(201B7株)の培養を行っております。

●現状の問題点
 先月に入り、フィーダーフリー状態で未分化維持培養中のhiPS細胞が継代時、凍結解凍時翌日の夜以降に丸くなって死滅する現象が発生し続け、色々な資材検討を行っているのですが全く解決しません。過去に問題なかったプロトコール通りに行っており、継代翌日・解凍翌日の朝は接着しているのですが、細胞死抑制剤が入った培地を除く作業である翌日の培地交換した後次の日には細胞が死滅しています。


●培養に関する使用試薬:
 @培地(AK02N)
 A細胞死抑制剤(Y27632)
 B細胞死抑制用の培地(AK02N+Y27632 10μmol/L)
 C洗浄用緩衝液(PBS)
 D剥離剤(Accutase)
 E凍結保護液(ステムセルバンカー GMP Grade)
 F接着用コート剤(ラミニン511)

●今までに検証した要素
 @培地・細胞死抑制剤・剥離剤・接着用コート剤・凍結保護液のロット
 A使用するμチップ・ピペットチップ・遠沈管・培養皿のロット
 B培養環境であるインキュベータ(温度・CO2濃度を計測機器で検証)
 Cコンタミネーションについて(死滅した細胞の培養皿を培養し続けても濁り
  等の異変は観察されない)

●細胞の様子:
 培養翌日の午前中は接着しているが2日目には死滅している。

●不可思議な点:
 細胞死する前の未分化hiPS細胞は同僚が培養している培養皿を1枚貰って各要素を検討しています。不可思議な点として、以下の点が挙げられます。

@先月に突然、細胞死の現象が発生しこれまでは同様の現象は発生していない。

A自身と同じ資材・プロトコールを使用した同僚が作業した細胞は死滅することはなく、問題なく培養されている。

B試しに、継代時の細胞回収操作は同僚が行い、同じ資材を用いて回収された細胞浮遊液を私が培養皿に播種する所だけ行ったとしても死滅する。(この時の同僚が播種する細胞に問題はない)

C翌日の接着は見られるが、2日目以降に細胞が死滅する。

D複数枚の培養皿に対して各要素について、検討したが全ての皿で死滅する。
(死滅する事に関して、100%の再現性がある)


およそ考えられる細胞死を引き起こしうる要素、@培養資材、A細胞、B培養環境、Cプロトコールについて検討しましたが解決せずにおり、困り果てております。

未分化hiPS細胞を培養したご経験がある方で、何かアドバイスを頂戴出来ましたら幸いでございます。

どうぞ宜しくお願い致します。
 
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4件 ( 1 〜 4 )  前 | 次  1/ 1. /1


KSR様 削除/引用
No.5978-4 - 2017/05/21 (日) 08:06:04 - キンパチ
KSR様ご連絡頂き、ありがとうございます。

〉引き起こされる細胞死はROCK依存のアノイキスでしょうか。
〉Yの濃度を2〜5倍にしてみる、
〉継代翌日の培地交換の際にもYを足す、最初の培地交換のタイミングを
〉翌々日に変更する等した場合に変化はありますか。

Yの濃度を少しだけ、弄ったこともありますが変化は見られませんでした。
また、培地交換までの日数を1、2日ずらしたとしても通常の培地交換したものとの変化は見られず、播種翌日は接着するのですが2日目以降の死滅は避けられませんでした。細胞死の様子ですが、凍結解凍後翌日の細胞が丸くなって浮いてくるような細胞死とは少し様子が異なり、膜が破れて内容物が出てくるような様子です。


〉乖離液がオリジナルのプロトコルとは違う気がしますが、
〉試しに戻してみてはどうでしょうか。

おっしゃる通り、剥離液を少し変えております。スクレーパーを用いないで綺麗に細胞回収する方法を模索していた時期があり、検討の中で通常のトリプルセレクトよりもこちらのほうが剥離効果が高いこともあり、半年ほど前から変えております。(先月まではこの剥離液を用いており、Aで検証した同じ資材で同僚が行った実験でもこちらの試薬を用いて問題が出ていないことも困惑している要因です)


〉B試しに、継代時の細胞回収操作は同僚が行い、同じ資材を用いて回収され
〉た細胞浮遊液を私が培養皿に播種する所だけ行ったとしても死滅する。
〉(この時の同僚が播種する細胞に問題はない)

私もこの点が、非常に奇妙に感じます。操作者の違いで継代後の細胞の様子が異なることはよく見られることですが、今回に限って同僚との差分を言えば、同僚播種後に自分が播種したため時間が数分違うこと、細胞浮遊液を1000μピペット(エッペンドルフの通常口チップ)で3、4回余分に撹拌されたことぐらいです。その後は同じインキュベータで培養されていたこともあり、死滅しうる要素としてはおよそ考えられにくいと自分では感じております。


細胞にやさしい資材・動きに注目してもう少し検証を重ねてまいりたいと思います。

KSR 削除/引用
No.5978-3 - 2017/05/21 (日) 07:33:37 - キンパチ

(無題) 削除/引用
No.5978-2 - 2017/05/20 (土) 19:09:24 - KSR
引き起こされる細胞死はROCK依存のアノイキスでしょうか。
Yの濃度を2〜5倍にしてみる、
継代翌日の培地交換の際にもYを足す、最初の培地交換のタイミングを
翌々日に変更する等した場合に変化はありますか。

乖離液がオリジナルのプロトコルとは違う気がしますが、
試しに戻してみてはどうでしょうか。

スクレーパーは使用されていますか。ロットが変わったりしていませんか。
スクレーパーに可能な限り力をかけず使ってみてください。
スクレープする際に回収用の培地をもとのプロトコルより多めに入れてやると、
細胞の生存率が改善したことがあります。

B試しに、継代時の細胞回収操作は同僚が行い、同じ資材を用いて回収された細胞浮遊液を私が培養皿に播種する所だけ行ったとしても死滅する。(この時の同僚が播種する細胞に問題はない)

この点が気になります。播くときにセルセイバー等の口径の大きいチップを使ってダメージを減らしてみてください。
また、翌日の培地交換も貴方と同僚の方の2人で試してみてください。

細胞が死んでしまう(フィーダーフリー化の未分化iPS細胞) 削除/引用
No.5978-1 - 2017/05/19 (金) 14:48:53 - キンパチ
細胞培養歴10年程の培養作業者です。

数年前からヒトiPS細胞(201B7株)の培養を行っております。

●現状の問題点
 先月に入り、フィーダーフリー状態で未分化維持培養中のhiPS細胞が継代時、凍結解凍時翌日の夜以降に丸くなって死滅する現象が発生し続け、色々な資材検討を行っているのですが全く解決しません。過去に問題なかったプロトコール通りに行っており、継代翌日・解凍翌日の朝は接着しているのですが、細胞死抑制剤が入った培地を除く作業である翌日の培地交換した後次の日には細胞が死滅しています。


●培養に関する使用試薬:
 @培地(AK02N)
 A細胞死抑制剤(Y27632)
 B細胞死抑制用の培地(AK02N+Y27632 10μmol/L)
 C洗浄用緩衝液(PBS)
 D剥離剤(Accutase)
 E凍結保護液(ステムセルバンカー GMP Grade)
 F接着用コート剤(ラミニン511)

●今までに検証した要素
 @培地・細胞死抑制剤・剥離剤・接着用コート剤・凍結保護液のロット
 A使用するμチップ・ピペットチップ・遠沈管・培養皿のロット
 B培養環境であるインキュベータ(温度・CO2濃度を計測機器で検証)
 Cコンタミネーションについて(死滅した細胞の培養皿を培養し続けても濁り
  等の異変は観察されない)

●細胞の様子:
 培養翌日の午前中は接着しているが2日目には死滅している。

●不可思議な点:
 細胞死する前の未分化hiPS細胞は同僚が培養している培養皿を1枚貰って各要素を検討しています。不可思議な点として、以下の点が挙げられます。

@先月に突然、細胞死の現象が発生しこれまでは同様の現象は発生していない。

A自身と同じ資材・プロトコールを使用した同僚が作業した細胞は死滅することはなく、問題なく培養されている。

B試しに、継代時の細胞回収操作は同僚が行い、同じ資材を用いて回収された細胞浮遊液を私が培養皿に播種する所だけ行ったとしても死滅する。(この時の同僚が播種する細胞に問題はない)

C翌日の接着は見られるが、2日目以降に細胞が死滅する。

D複数枚の培養皿に対して各要素について、検討したが全ての皿で死滅する。
(死滅する事に関して、100%の再現性がある)


およそ考えられる細胞死を引き起こしうる要素、@培養資材、A細胞、B培養環境、Cプロトコールについて検討しましたが解決せずにおり、困り果てております。

未分化hiPS細胞を培養したご経験がある方で、何かアドバイスを頂戴出来ましたら幸いでございます。

どうぞ宜しくお願い致します。

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