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(無題) 削除/引用 No.5990-15 - 2017/05/30 (火) 02:50:26 - おお 血清に関してはあなたの実験、物次第でしょう。定石はありません。 血清存在下であなたの物が加わって効果があるならそれでかまわない場合もあります。ぶっちゃけ血清の入った培地で維持してそれに精製品を加えることが多い中、その物が分泌されているFBS入りの培地をそのまま使って何が悪いのかとも言えます。しかしながら単品ではないなら単独の効果を見ているかなど厳密な評価に結論を出せるかという視点では慎重な対応が必要です。加えて精製するときは血清は結構邪魔な存在ではあります。 無血清のDMEMに変えて一日ぐらいは大丈夫というかたもいます。それでもやはり細胞が分泌しているのはあなたが発現させたものだけではありませんし、このような実験のための無血清培地も売っていますがたしかIGFなど増殖因子が入っているかと思います。 少し実験の目的などに立ち返って考えてみるといいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.5990-14 - 2017/05/29 (月) 19:01:59 - もぐ 皆様 ご助言ありがとうございます。 タグの付加を検討したうえで実験を考え直してみます。 また別件になりますが、分泌性因子の効果を検証する上で、培地中のFBSの存在はどのようにお考えになっているでしょうか？ 自分としてはFBSを除去したいのですが、そうするとHEKが元気に生きてくれません。調べてみたところ無血清のHEK培養培地なるものがいくつかヒットしたのですが、こういったものをお使いになられた方がいましたらご感想いただけないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5990-13 - 2017/05/28 (日) 08:20:17 - おお あ、あとタグはWBで検出できればいいのかIPなどでプルダウンできないと困るのかなどでも若干付け方で違いが生じると思います。IPは露出していないと無理があるので、若干余分な配列（リンカー）を加えたほうがいい場合もあると思います。ただこれも結果オーライです。

(無題) 削除/引用 No.5990-12 - 2017/05/28 (日) 06:35:38 - X 同様の実験をやってますが、かなりラフにやってもそこそこ行く感じです（タンパクによるとは思いますが）。私の場合、HEK293Tに一晩トランスフェクション（一過性です）した直後から無血清（DMEMと抗生剤だけ）にして、４日間培養して培地を回収しています。精製用に10xHisをC末につけてますが、培地への分泌は、抗His抗体ではなく分泌蛋白そのものに対する抗体を用いたウエスタンで確認してます（抗His抗体はかなり非特異が出てしまうので）。無血清では確かに剥がれやすくなるのですが、トランスフェクション開始時の細胞密度をかなり上げる（サブコンフルエントくらい）と、トランスフェクション終了時にはちょっとオーバーコンフルエントくらいの感じになり、この状態で無血清にすると４日はもつようです（多少浮遊細胞も出ますが、ほぼコンフルエントな状態で維持できてます）。精製前の培地を、他の細胞の培養に加えて機能を見る実験もしてますが、この場合は、必ず空ベクターのトランスフェクションを並行して行い、その培地をコントロールとして用いています（このコントロール培地は、ウエスタンやco-IPのネガコンにもなるので、重宝してます）。

(無題) 削除/引用 No.5990-11 - 2017/05/26 (金) 09:23:54 - おお タグの付け方に決まった方法はありません。なぜならそれで活性が維持できるかは結果論ですから。何かつけるだけでだめな場合もあるだろうし、つける配列によってはうまくいく場合もあるでしょうし。長いとだめな場合もあるでしょうし、かといってGFPつけても活性があるときもある。先行研究なども探してみてください。

(無題) 削除/引用 No.5990-10 - 2017/05/26 (金) 08:29:18 - もぐ おお様 ありがとうございます。 現在のベクターはコンストラクションが使いやすいので、そこに既存のタグ付ベクターの配列を組み込もうと思います。 全長の分泌性因子のC末側にタグを付ける場合は、目的遺伝子配列直後にタグ配列を付け加え、終止コドンはタグ側にすればよろしかったでしょうか？それとも目的遺伝子とタグの間に制限酵素サイトを付与しても機能に大きな影響はないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5990-9 - 2017/05/26 (金) 07:20:50 - おお タグを入れたほうが（活性などはおいといて）やりやすいと思いますが、特異的抗体があれば、WBかELISAでも検出できるかと思います。スペシフィックな活性を見る系があればそういうのでもいい場合もあるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.5990-8 - 2017/05/26 (金) 07:09:28 - もぐ mon様、おお様 ご助言ありがとうございます。 >薬剤セレクションで除去したものは目的の因子が組み込まれているので、ひとつずつチェックする必要はないという意見もいただきました。 使用予定のベクターにはタグ配列がありません。 以前、本フォーラムでも質問がありましたが、インサートのC末にタグ配列を付加すれば簡便にチェックできるという認識でよろしかったでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5990-7 - 2017/05/25 (木) 06:21:36 - おお >一方で、薬剤セレクションで除去したものは目的の因子が組み込まれているので、ひとつずつチェックする必要はないという意見もいただきました。 確かにベクターなどの性質にもよるとおもいますが、私ならチェックします。実際どのようにインテグレートされてその構造で維持されているかどうか見えない部分が多いので。また分泌された量などの把握も必要じゃないでしょうか。 活性として必要量取れているとか、クローン間で大きな違いがあるとか。

(無題) 削除/引用 No.5990-6 - 2017/05/25 (木) 05:15:21 - mon > 薬剤セレクションで除去したものは目的の因子が組み込まれているので、ひとつずつチェックする必要はないという意見もいただきました。 薬剤耐性遺伝子の発現ベクターの構成によります。 別ベクターや目的遺伝子と同じベクター上でも別プロモーターで発現させていると、目的遺伝子のプロモーターのサイレンシングが生じやすいです（特にウィルス由来のプロモーターの場合）。 これを克服するため、IRESやT2Aで繋いでbicistronicに発現させれば、薬剤耐性=目的遺伝子の発現が保証されます。 サイレンシングされにくくするゲノム由来DNA領域を組み込んでおくのも良いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5990-5 - 2017/05/24 (水) 18:15:02 - もぐ 皆様ご回答ありがとうございます。 血清濃度を踏まえ、その使用の必要性についてもう一度検討してみます。 別の質問になるのですが、分泌性因子を導入した細胞の確認について疑問があります。 一般的には、分泌性因子の存在の有無を、タグ付ベクターや抗体で培養上清に含まれるかどうかを確認すると思います。一方で、薬剤セレクションで除去したものは目的の因子が組み込まれているので、ひとつずつチェックする必要はないという意見もいただきました。 上記の点について、皆様はどのように対応されているのかご意見いただけないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5990-4 - 2017/05/24 (水) 09:31:56 - mon 無血清培地を使用しても細胞由来の成分がいろいろと混入します。 そのため精製しない限り trackerさんの指摘のようにnegative controlが必要になります。 また、HEK293 (T)なら、DMEM/F12+ITS+CD Lipid Concentrateに馴化できましたが、非常に剥がれやすくなります。また分泌量を上げるには、Yeast ExtractsやTC Yeastolateの添加が有効です。 VPA添加(0.5~4mM)が有効な場合もあります。 なお、経験は少ないですが、浮遊培養系ExpiCHO(Expi293) systemや、CHOgro systemは接着培養(一過性発現）の10倍〜100倍収率が良かったです。

(無題) 削除/引用 No.5990-3 - 2017/05/23 (火) 21:17:17 - み その手の実験のために無血清培地が販売されています。

(無題) 削除/引用 No.5990-2 - 2017/05/23 (火) 19:56:13 - tracker 具体的に問題となる影響はなんですかね。血清により動くシグナルと分泌因子のシグナルが被るとか？ とりあえずその因子を発現していない親株の培養上清と比較するのではダメですか？ また分泌因子自体の機能を直接的に調べるなら、おっしゃる通り精製するほかないような気がします。 血清濃度を下げるにせよ培養上清を使う限りは、あくまで「その条件下での培養上清の効果」までしか示せないですし

HEK293T細胞を用いる分泌性因子の濃縮 削除/引用 No.5990-1 - 2017/05/23 (火) 18:20:57 - もぐ ある分泌性因子を発現するHEK293T細胞を作製して、培養後の培地を使い実験したいと考えています。 通常のHEK293T細胞の培地には10% FBSが添加されていますが、この影響を取り除きたいと考えています。しかし、FBS抜きの培地で培養したところ細胞が剝がれてしまい困っています。 そこで質問ですが、培地中からFBSの影響を取り除きたい場合は、FBS濃度を段階的に下げていく方法や特別な培地が販売されているのでしょうか？ それともFBS入り培地で培養して、後にイオンカラム等で精製する必要があるのでしょうか。

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