BioTechnicalフォーラム [InfusionのためのPCR]

InfusionのためのPCR

No.6003-TOPIC - 2017/05/30 (火) 17:57:06 - ぱぐ

Infusionを用いたPCRを行っているのですが、目的のプロダクトが得られず困っています。

目的遺伝子を全長で得る必要があり、尚且つInfusionを使用する実験を行っています。アダプター配列とインサート（開始コドンと終止コドン）を挟むようにプライマーを設計しているのですが、PCRでうまく目的のプロダクトが得られません。

そこで２点質問したいのですが、①今回の実験ではプライマー配列をあまりいじれないようにも思うのですが、さらに長くしたり、PCR方法で工夫する方法はありますでしょうか。②4k程度のものを増幅したい場合、一回でPCRをかけるよりも、インサート内を何か所か分けて合成し、ライゲーションでつなげていくという方法もありなのでしょうか？

PCRではPrimeSTAR HSを使用しています。
ご助言いただけると幸いです。
　

- このトピックにメッセージを投稿する -

全5件 ( 1 ～ 5 )　前 | 次　1/ 1. /1

(無題)

削除/引用

No.6003-5 - 2017/05/31 (水) 22:42:50 - cDNA

私は同じような悩みでIn-Fusionをやめました。必要なDNA量が普通のライゲーションより多いので、PCRでの増幅が悪い時に改善が難しいです。

時々やる方法としては、Nested PCRの逆のようなやり方ですが、長いプライマーを少なめに入れておいて、増幅される断片がさらに増幅できるような、短いプライマーも入れてPCRします。短いプライマーは最初のテンプレートには結合せず、一旦増えたものだけをテンプレートに出来る配列です。

説明が分かりにくいかもしれませんが、SmaerterRACEの説明書を見ると同じような事をやっています。呼び名があるかもしれませんが、不勉強で知りません。

(無題)

削除/引用

No.6003-4 - 2017/05/31 (水) 08:01:10 - plz

4kなら特に長いとは思いませんが、どうしても増えないというのであれば、３個とかに分けて増幅したフラグメントとベクターをいっぺんにIn-Fusionで反応させてやればいいと思います。

(無題)

削除/引用

No.6003-3 - 2017/05/30 (火) 20:47:10 - mon

(1)目的配列にマッチする領域を長めに設定して(25~30mer 程度)２step PCRを試みる。標的がcDNAなら、cDNAライブリーの由来にも注意してください。
(2)PCRは短い方が増幅効率が良いので、1kb程度に分割するのも一法です。オーバラップ領域(15-25base)で目的の全長にPCRで連結出来ます。
希にPCRでの連結が成功しない場合は、BsaI(or Esp3I)+Ligaseを用いてPCRではない方法(Golden Gate法というらしい）で連結する方法もあります。

(無題)

削除/引用

No.6003-2 - 2017/05/30 (火) 18:13:46 - AA

Infusionはプライマーのデザインツールも公式提供のがあるので
あまりいじるのが難しいですね。
思い切って酵素を変えるとうまくいくケースもあります。
PrimestarHSも良い酵素ですが、PrimestarのGXLはさらに増えにくいサンプル向けです。

あと、4kで全長だと小さめの遺伝子ですが、これはCDSでしょうか？ゲノム上でのサイズでしょうか？
以前自分でもやったので恥ずかしい話なのですが、鋳型は正しいものを使われていますか？
cDNAであればゲノムからは増えないので、cDNAライブラリから増やす必要があります。

ばらばらで増やしてつなぐというのは余り現実的ではない気がします。
作業も煩雑になりますし。

InfusionのためのPCR

削除/引用

No.6003-1 - 2017/05/30 (火) 17:57:06 - ぱぐ

全5件 ( 1 ～ 5 )　前 | 次　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

〔使い方〕

「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。