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(無題) 削除/引用 No.6007-19 - 2017/06/03 (土) 04:19:02 - 名無し >とりあえずスポンジを新しく買い替えたら。 実際にスポンジが古くなって転写ムラが出来るようになり（時には全然転写されないこともあった）、買い替えて新しいスポンジでやったら問題が解決したことがあります。 実は、新しいスポンジを注文後に品物が届く前に古いスポンジを重ね（マニュアルでは二枚ないし三枚で済むところを、四〜六枚）てやってみたらその時点で問題が解決してしまい、新しいスポンジ買わんでも良かったな、となったのですが。

(無題) 削除/引用 No.6007-18 - 2017/06/03 (土) 02:48:08 - 転写乙 ATTOのWETのblotterは使ったことないけど、スポンジとか入れて閉じるタイプか?。ならばたぶんスポンジが経年劣化で薄くなり、密着が悪くなって転写不良になっているのだとおもう。低分子量領域は抜けてるのでなくて、電気流して蛋白質は膜とゲルの隙間に出て行くだけで、膜に写っていないのではないのではないか？。高分子量領域が写りにくく、低分子量領域は写り過ぎて抜けるという相反することが同時におこるのはちょっとあり得ない気がするし。とりあえずスポンジを新しく買い替えたら。それがすぐには無理なら、ろ紙の枚数を倍くらいに増やすとかしてみたら。 8がCHAPSって言ってるけど、CAPSでだいじょうぶだね、ていうか１あるいは1の仲間はバッハー作るときこの２つを取り違えてないよね？。昔似たような痛いミスをしたもので。

(無題) 削除/引用 No.6007-17 - 2017/06/02 (金) 10:07:42 - transfer 断線の可能性に関してはどの転写装置を使用しても変わらなかったため可能性は低いと思っています。 ですがこれまでの方々のアドバイスから、それでも転写装置を調べるのは必要そうですね。 他にもバッファーのpHやゲルについてのご指摘があったので、それら3点を一度再考してみようと思います。 この度は私の質問にお付き合いくださりありがとうございました。 もし、この現象の原因がわかったら改めて投稿させていただくかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6007-16 - 2017/06/02 (金) 04:25:43 - おお そうですね、、、電流が下がるかどうかはないかもしれませんね。ゲルを挟んだ状態がゆるゆるになって部分的に隙間ができてるのかというのを疑ったのですけど。 電極が白金線などで張り巡らされていると思いますが、途中で断線しているとかないでしょうか、、、

(無題) 削除/引用 No.6007-15 - 2017/06/01 (木) 13:11:31 - transfer >>げると膜の間に隙間ができてしまっている部分がある可能性はないですか？ ゲルと膜を重ねた際にバッファーをかけて、その上にろ紙を重ねたときにバッファーをかけています。 断じて隙間はない、とは言い切れませんが可能性は低いのではないでしょうか。 ちなみに、隙間があると転写時の電流も変化するのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6007-14 - 2017/06/01 (木) 12:55:45 - おお >ゲルの両端で転写にムラができている、 げると膜の間に隙間ができてしまっている部分がある可能性はないですか？

(無題) 削除/引用 No.6007-13 - 2017/06/01 (木) 12:13:57 - transfer 補足です。 転写にムラができる、という表現をしましたが、転写装置は異なるものを使用しています。 （これまで2回転写を行い、1回目と2回目で転写時には別の装置を使用しているということです。） つまり転写にムラができたものの、どの転写装置使っても綺麗に転写が行われなかったということです。 そのため装置に異常が生じているという可能性は低いと考えています。 （使用した全ての転写装置が壊れているという可能性は否定できませんが...）

(無題) 削除/引用 No.6007-12 - 2017/06/01 (木) 12:03:00 - transfer >>例えばゲルを挟んでいるスポンジやろ紙なんですが、、、ろ紙が最近変わったとかありますか？スポンジは長期使っていると目詰りしてきてトランスファーがきれいにいかなくなることもあるようです。 ろ紙が変わったといえば変わりました。 これは特別なろ紙に変わったというわけではなく、転写用のろ紙がなくなったので新しく切って作ったという意味です。 ろ紙の変化はそのくらいです。 ですが、ろ紙が変わってから2回WBをしましたが、その2回ともいつも通りの転写ができませんでした。 >>日本エイドーにも問い合わせてみたらどうでしょう、 もし同じ研究室の人が同様に実験を行ってもうまく転写されていなかったら問い合わせてみたいと思います。 >>もう一つはPVDF膜を通過してしまうというのが気になりますね。。。どれくらいの分子量でしょうか。普通見られるようなレンジであまり通過するような気がしないですけど、、、SDSがバッファーに混じっているとかじゃないと。。。 マーカーでの判別になりますが、75kは2-3割通過してしまっている印象です。特にstacking lineって言えばいいんですかね？ゲルの一番下に見えるlineは5割くらいがろ紙に行ってしまっています。 また、sampleの両端にMarkerを挟んで泳動→転写しました。すると片側のMarkerは250kや150kはゲルにかなり残っています。7割ほどでしょうか。 ですが、もう片方のMarkerは全体的にうまく転写されているようでした。 ゲルの両端で転写にムラができている、と表現したらいいのかもしれません。 [CV,45mV,60min(転写開始時の電流80mA)] SDSの混入は考えづらいです。バッファー作成時は、StockのCAPSとメタノール、蒸留水にしか触れませんから...。 >>アクリルアミドの劣化,AMPS,TEMED 次の泳動で未使用のアクリルアミドを使用して見たいと思います。 AMPSに関しても新しいAMPSを使用したいと思います。 TEMEDに関しては、匂いがきついのでまだ使用できると思います。 >>分離ゲル、濃縮ゲルのpH、Sample buffer ラボ共通のものを使用しており、且つ私以外の人で同じように泳動・転写に異常が生じた報告はないので問題ないと考えています。 上記の理由でpHは確認していないのですが、他の回答者の方もpHを気にされているので確認したいと思います。 Sample bufferも既製品のものを使用しているので気には止めていませんでした。pHcheckか新規のものを使用して見たいと思います。Sampleの色に関してですが、前と変わらず青？色です。（少なくとも黄色ではなかったです） >>Membraneのlot 申し訳ないことにMembraneのlotまではこれまで確認してきませんでした。今後の実験では意識したいと思います。 今回の現象として、(Marker基準)250kDaはゲルに残っていることから、問題がPVDF膜にある可能性は低いと考えているのですがどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6007-11 - 2017/06/01 (木) 03:54:13 - PYK 私もSDS-PAGEやTransferで色々と問題がありました。 その際、私なりに気づいた点がありましたので、参考になれば幸いです。 （直接、トピ主様の問題と関係ないことがあるかもしれませんが） 1) ゲル 他の方も指摘しておりますが、アクリルアミドの劣化は英動が乱れます。 また、私は以前古くなったAPSやTEMEDを使用していた時、電気泳動がいつもと違うなと感じたことがあります。特にAPSは劣化が速いので、最近は1-2ヶ月毎に新たに作っています。TEMEDに関しては、匂いを嗅いで臭かったらOKっていう人は多いですね。 2) pH 分離ゲル、濃縮ゲルのpH（8.8と6.8でしたっけ？）は問題ないでしょうか？ごく稀にpHがずれていて、泳動がおかしくなることがあるそうです。また、Sample bufferのpHも6.8でしょうか？トピ主様のサンプルの状況がわかりませんので何とも言えませんが、例えばサンプルにトリクロロ酢酸が混入してますと（TCA沈殿後）等、Sample bufferが黄色になり、泳動に影響が出るとのことです。 3) Membrane 私は以前PVDF膜を使用していた時、急に低分子量（25kDaくらい）のタンパク質の検出ができなくなりました。Sampleの取り直しや、Buffer類全て作り直してもダメでした。色々と模索した結果、PVDF膜のLotが変わった、という結論に至りました。確かに新しいLotでは検出できないのに対して、残っていた古いLotでは同条件下でworkしていました。この時はPVDF膜を2-3枚重ねてtransferし、最も外側の膜を検出するという荒技で対応しました。（もったいなかったのですが、博士発表直前ということもあり、無理やりしました） その他に関しては、他の方がおっしゃるよう、これまでと違う新しいLotの試薬がBuffer類に混ざって、それが悪さしているか、電極の問題か、Sampleが劣化しているか、、、という感じですが、やはり直接見てみないとわかりませんよね。。

(無題) 削除/引用 No.6007-10 - 2017/06/01 (木) 03:08:08 - おお >転写時に電流がいつもより低かった場合 ぱっとみていて一番気になったのはここなんですが、どうも極端に低くなっているのでバッファーがわるいか、電流の流れ方が何の原因で妨げられているかもという気がしています。 電流の流れについては装置の接触不良とかもあるかもしれませんけどその他は、、、実際見てみないとわからない、、、見てもわからないかも、、、 例えばゲルを挟んでいるスポンジやろ紙なんですが、、、ろ紙が最近変わったとかありますか？スポンジは長期使っていると目詰りしてきてトランスファーがきれいにいかなくなることもあるようです。 日本エイドーにも問い合わせてみたらどうでしょう、あそこは昔かなりユーザー向けのサービスをしてくれてた印象があります。色々とトラブルに関して情報も持っているかもしれません。 もう一つはPVDF膜を通過してしまうというのが気になりますね。。。どれくらいの分子量でしょうか。普通見られるようなレンジであまり通過するような気がしないですけど、、、SDSがバッファーに混じっているとかじゃないと。。。

(無題) 削除/引用 No.6007-9 - 2017/05/31 (水) 23:02:44 - transfer >>ところでCHAPSのトランスファバッファって知らないのだけど、組成を教えてくれないか（あとざっと作り方を）？ 10mM CAPS, 10% Methanol, pH11で調整しています。 >>同じ試薬、機器を使っている他のユーザーはうまくいってるのですか？ 今、他の人はウエスタンを行なっていないので正確な回答はできませんがこれまでは特に問題はなかったそうです。 その人たちが次にウエスタンを行うときに私もそばで操作を見るつもりです。 >>泳動と転写は同じパワーサプライをお使いでしょうか？ 異なるパワーサプライを使用しているので、そちらは正常だと思います。 繰り返しで申し訳ありませんが、転写時に電流がいつもより低かった場合はどうしたらいいと思いますか？ 例えば、より低いvoltageで長時間転写させることも可能なのでしょうか？ 私としてはとっさに転写時間やvoltageを変えることに抵抗があるのですが、アリならばやってみてもいいのかなと思い...。

(無題) 削除/引用 No.6007-8 - 2017/05/31 (水) 20:25:28 - AP ATTOはタンクブロットの装置やってないな。セミドライだけだ。 日本エイドーというほうが正しいんですね。 現象としては、従前より電導度が下がっている（抵抗が上がっている）ってことで間違いないでしょう。 やっぱりバッファーが一番怪しいけどな。研究室でがっちりプロトコールをコントロールしてるんなら、間違いが起こるスキはあまりないが、 間違った試薬に変わった（似た名前の試薬、塩か遊離酸塩基かとかで間違えることはよくある）、pHメーターが狂ってる、天秤が狂ってる。 ところでCHAPSのトランスファバッファって知らないのだけど、組成を教えてくれないか（あとざっと作り方を）？　なにかヒントがあるかも。

(無題) 削除/引用 No.6007-7 - 2017/05/31 (水) 20:12:04 - AP >>>チャンバーの電極関係ですかね…金属板が反れてきていませんか？ それってセミドライの話じゃ？ 質問者はwetといっていますが。

(無題) 削除/引用 No.6007-6 - 2017/05/31 (水) 17:43:00 - 0 ＞強いていうなら60minで泳動が終わるところ、最近は90min近くかかっています...。 泳動と転写は同じパワーサプライをお使いでしょうか？ 転写だけでなく、泳動の方にも変化があったということは、パワーサプライ側を疑ってみるのもアリかと思います。 電極板が反る、というのは…実際にそうなってしまっていたら見たらわかると思いますので、 目視で特に問題ないようでしたら大丈夫だと思います。

(無題) 削除/引用 No.6007-5 - 2017/05/31 (水) 17:32:42 - f 同じ試薬、機器を使っている他のユーザーはうまくいってるのですか？

(無題) 削除/引用 No.6007-4 - 2017/05/31 (水) 16:50:31 - transfer >>うちも似たようなことがあって、転写の問題かと思っていたらアクリルアミドストックの劣化で泳動の時点で低分子が逸失したことがありましたので。 低分子の逸失を経験したことがないのでどういう状況かわかりませんが、おそらくそれはないと思います。 7.5%の分離ゲルで低分子を観察していないのでなんとも言えませんが...。 強いていうなら60minで泳動が終わるところ、最近は90min近くかかっています...。 電流がうまく伝わっていないだけだと思っており、その点に関しては『90min泳動すればいい』と思っていたのでさほど問題視していませんでした(-_-;) アクリルアミドの劣化で泳動も遅くなるのでしょうか？？ それと、ゲルを作る際の試薬はラボ共通なので問題ないと思います。 >>ひとまずすぐに調べられそうな点として、作り置きしたバッファーの状態でしょうか… バッファーを新しく作り直してみましたが、改善はされていませんでした。 >>チャンバーの電極関係ですかね…金属板が反れてきていませんか？ 別の機器で泳動してみたのですが結果は変わりませんでした。 金属板が反れている状況がわかりません..。具体的に教えていただけますか？ 日本エイドーの機器を使用しています。 それと転写時にCV45V,60minで80mA(いつもなら１５０mAくらい )だった時は、どう対処するべきなのでしょうか??

(無題) 削除/引用 No.6007-3 - 2017/05/31 (水) 14:58:11 - taka 確認ですが、泳動の時点では問題ないのですよね？ うちも似たようなことがあって、転写の問題かと思っていたらアクリルアミドストックの劣化で泳動の時点で低分子が逸失したことがありましたので。

(無題) 削除/引用 No.6007-2 - 2017/05/31 (水) 14:13:49 - 0 ひとまずすぐに調べられそうな点として、作り置きしたバッファーの状態でしょうか… いつから作りおいて、どのように保存・使用しているのかわかりませんが、劣化していませんか？ とりあえずpHを測ってみるというのはどうでしょう あとはチャンバーの電極関係ですかね…金属板が反れてきていませんか？

ウエスタンブロットの転写が綺麗にいかない 削除/引用 No.6007-1 - 2017/05/31 (水) 11:49:34 - transfer 初質問なので足らない情報があると思いますが都度聞いてください。 ウエスタンブロットの転写についての質問です。 当研究室ではAttoの転写装置を用いてwetで転写しています。 初めの頃は問題なく転写できていたのですが、ここ最近、高分子量はゲルに残り、低分子量はPVDF膜を通過してしまう現象が起こっています。 そのため検出時にも大きな影響が生じてしまうので非常に困っています。 この事態の原因・解決方法をおしえていただけると幸いです。 よろしくお願いします。 細かい設定ですが、転写のバッファーはCAPS・メタノールを含ませています。 転写時の設定はCV,45V,60min,4℃で機器の取扱説明書に記載された設定且つ研究室で統一された方法なので変更することはできません。 転写時に電流を観察するとstartが50mA-100mAなのでいつもより低い印象です。(いつもは150mA) また、転写を開始する前に、転写装置やバッファー、ろ紙は4℃に置いています。 バッファーは作り置きしています。 また、バッファーに関しては研究室で統一しているので変更することはできません。 他に足らない情報があれば随時対応します。

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