Bio Technical フォーラム

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qPCRについて トピック削除
No.6021-TOPIC - 2017/06/07 (水) 00:28:42 - mimi
いつもお世話になっております。
基礎研究を始めたばかりの初心者です。最近、qPCRをやり始めたのですが、その結果の解析について疑問があります。かなり基礎的なことかもしれませんが、ご教示いただければ幸いです。

現在、細胞実験をしており、とある遺伝子Xの発現が、薬剤Yによりどう変化するかということを確かめる実験をしています。PCR効率が2近いのことは確認しており、ΔΔCt法での解析を試みています。N/C群、Y群とそれぞれ3サンプルずつPCRを行い、結果が以下のようになったとします。house keepingはGAPDHを用いています。
　　GAPDH　X　　ΔCt
NC1　16　 19　　3
NC2 17　　20　　3
NC3 16 20　　4
Y1 17　　19　　2
Y2 16　　19　　3
Y2 17　　19　　2

この時、N/C群に対してY群でのXの発現が増加しているかどうかっていうことを調べたいんですが、NC1に対しての相対発現量を計算した場合、

　　GAPDH　X　　ΔCt　ΔΔCT　相対発現比
NC1　16　 19　　3　　　0　　　　1
NC2 17　　20　　3　　　0　　　　1
NC3 16 20　　4　　　1　　　　0.5　　　NC群平均0.83
Y1 17　　19　　2　　　-1　　　 2
Y2 16　　19　　3　　　0　　　　1
Y2 17　　19　　2　　　-1　　　 2　　　　Y群平均1.67

というようになって、NC群での発現比の平均が1にならず、グラフ的には気持ち悪いグラフになってしまいます。これはどこか解釈が間違っているのでしょうか？まずNC群、Y群の各群ごとにΔCt値の平均を出し、それをもとに計算すれば、NC群を1とした時のY群の発現比はでますが、その場合標準偏差をどのように計算すればいいかがわかりません。
laboの先輩方は、各サンプルごとに2^(-ΔCt)でcontrol遺伝子に対する発現量の比を出し、それをNC群の平均で割ればいい、またその数値をつかって標準偏差や有意差検定をすればいいと言っておられるんですが、確かに数値・グラフ的にはきれいになるも、ΔΔCt法といっていいのが疑問です（以下例です）。

　　GAPDH　X　　ΔCt　2^(-ΔCt)　NC群の平均(0.104)で除算
NC1　16　 19　　3　　　0.125　　　1.20
NC2 17　　20　　3　　　0.125　　　1.20
NC3 16 20　　4　　　0.063　　　0.60　　　NC群平均1.0
Y1 17　　19　　2　　　0.25　　　 2.40
Y2 16　　19　　3　　　0.125 1.20
Y2 17　　19　　2　　　0.25 2.40　　　Y群平均1.53

かなり初歩的な質問であることは自覚しているのですが、皆様が普段どのように解析をなさっているが、ご教示のほどよろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.6021-3 - 2017/06/07 (水) 13:34:10 - mimi
ご回答ありがとうございます。
おっしゃる通り、目的としては比較することなので、必ずしもΔΔCt法を使わずとも、ΔCt値のみで解析してもいいというのは目から鱗でした。どこのqPCR解説書を見ても、ΔΔCt法の解説しか載っていなかったので...。

となると、逆に気になるのが、ΔΔCt法の利点というか、どのような場面で使うのが適切なのでしょうか。
基本的には2^(-ΔCt)で各サンプルごとに内在性controlに対する標的遺伝子の発現比が算出できると思うので、あえてある1サンプルをゼロ点としてΔΔCt値を出すよりも、2^(-ΔCt)のまま処理してしまったほうが、いろいろと統計処理もしやすいような気がします。多くの論文ではコントロール群においてもエラーバーとして標準偏差が示されていることを考えると、実際そのように処理しているのではないかと思うのですが。

的違いな疑問であれば申し訳ありません。

(無題) 削除/引用
No.6021-2 - 2017/06/07 (水) 04:52:33 - おお
ΔΔCt法を使うのが目的ですか？それとも比較するのが目的ですか？

ΔCtを比較するだけで十分発現量の差を見ることができますのでΔCtの計算でグラフ化してもいいのですよ。

NC1とY1がセットの実験だったら、両者の比較からΔΔCtを計算するのも手です。おしめしのΔΔCTの計算だったらΔCTの計算と実質変わらない。まあ結局比だからコントロール１にすることはどちらの場合もできますけど。

３っつ目の計算はCT自身が量と直線的な関係になってないのでそれに直しただけ。そのほうが王道と私は思うけど、Ct値を（直線的な関係に直さないで）そのまま使って計算する人も多いと思う。

qPCRについて 削除/引用
No.6021-1 - 2017/06/07 (水) 00:28:42 - mimi
いつもお世話になっております。
基礎研究を始めたばかりの初心者です。最近、qPCRをやり始めたのですが、その結果の解析について疑問があります。かなり基礎的なことかもしれませんが、ご教示いただければ幸いです。

現在、細胞実験をしており、とある遺伝子Xの発現が、薬剤Yによりどう変化するかということを確かめる実験をしています。PCR効率が2近いのことは確認しており、ΔΔCt法での解析を試みています。N/C群、Y群とそれぞれ3サンプルずつPCRを行い、結果が以下のようになったとします。house keepingはGAPDHを用いています。
　　GAPDH　X　　ΔCt
NC1　16　 19　　3
NC2 17　　20　　3
NC3 16 20　　4
Y1 17　　19　　2
Y2 16　　19　　3
Y2 17　　19　　2

この時、N/C群に対してY群でのXの発現が増加しているかどうかっていうことを調べたいんですが、NC1に対しての相対発現量を計算した場合、

　　GAPDH　X　　ΔCt　ΔΔCT　相対発現比
NC1　16　 19　　3　　　0　　　　1
NC2 17　　20　　3　　　0　　　　1
NC3 16 20　　4　　　1　　　　0.5　　　NC群平均0.83
Y1 17　　19　　2　　　-1　　　 2
Y2 16　　19　　3　　　0　　　　1
Y2 17　　19　　2　　　-1　　　 2　　　　Y群平均1.67

というようになって、NC群での発現比の平均が1にならず、グラフ的には気持ち悪いグラフになってしまいます。これはどこか解釈が間違っているのでしょうか？まずNC群、Y群の各群ごとにΔCt値の平均を出し、それをもとに計算すれば、NC群を1とした時のY群の発現比はでますが、その場合標準偏差をどのように計算すればいいかがわかりません。
laboの先輩方は、各サンプルごとに2^(-ΔCt)でcontrol遺伝子に対する発現量の比を出し、それをNC群の平均で割ればいい、またその数値をつかって標準偏差や有意差検定をすればいいと言っておられるんですが、確かに数値・グラフ的にはきれいになるも、ΔΔCt法といっていいのが疑問です（以下例です）。

　　GAPDH　X　　ΔCt　2^(-ΔCt)　NC群の平均(0.104)で除算
NC1　16　 19　　3　　　0.125　　　1.20
NC2 17　　20　　3　　　0.125　　　1.20
NC3 16 20　　4　　　0.063　　　0.60　　　NC群平均1.0
Y1 17　　19　　2　　　0.25　　　 2.40
Y2 16　　19　　3　　　0.125 1.20
Y2 17　　19　　2　　　0.25 2.40　　　Y群平均1.53

かなり初歩的な質問であることは自覚しているのですが、皆様が普段どのように解析をなさっているが、ご教示のほどよろしくお願いいたします。
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