Bio Technical フォーラム

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タグ付きタンパク恒常発現株について トピック削除
No.6070-TOPIC - 2017/06/22 (木) 20:40:42 - 変異体マン
現在私はあるタンパクAの野生型と変異型をHEK293T細胞とcos-7細胞にレトロウイルスによる感染法により恒常発現させた株を作製しました。(タンパクAにはHAタグをつけています)
発現確認実験をウェスタンブロットにより行った結果、
cos7ではHA抗体及び、タンパクA抗体で発現が確認できた一方、
HEK293TではHA抗体で野生型のみ検出(変異体はわずかにシグナルを検出)、タンパクA抗体では野生型、変異型どちらも検出されました。

細胞によってタグの検出のしやすさ、細胞内での修飾などによりこういった現象は起こりうるのでしょうか。このような経験のある方ご指導お願いいたします。
 
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(無題) 削除/引用
No.6070-2 - 2017/06/23 (金) 04:15:22 - おお
HA-tagの修飾は聞いたことがありませんねぇ、、、もし起こっているということを知っている方がいれば私もお話を伺いたく思います。

定量性についてどの程度担保されているのかまず確認したいところですが、フィルムの場合バンドが弱いときはかなり差があるように見えるが、くっきりバンドが現れるときは同じぐらいに見えるということもありますので。

あとの可能性は変異体がプロテアーゼなどのアタックを受けやすくてタグの方の末端が削れやすくなっているとか。

タグ付きタンパク恒常発現株について 削除/引用
No.6070-1 - 2017/06/22 (木) 20:40:42 - 変異体マン
現在私はあるタンパクAの野生型と変異型をHEK293T細胞とcos-7細胞にレトロウイルスによる感染法により恒常発現させた株を作製しました。(タンパクAにはHAタグをつけています)
発現確認実験をウェスタンブロットにより行った結果、
cos7ではHA抗体及び、タンパクA抗体で発現が確認できた一方、
HEK293TではHA抗体で野生型のみ検出(変異体はわずかにシグナルを検出)、タンパクA抗体では野生型、変異型どちらも検出されました。

細胞によってタグの検出のしやすさ、細胞内での修飾などによりこういった現象は起こりうるのでしょうか。このような経験のある方ご指導お願いいたします。

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