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ウエスタンでタンパク確認できない トピック削除
No.6089-TOPIC - 2017/07/01 (土) 02:54:19 - ria
初心者です。いつも勉強させていただいてます。よろしくお願いします。

目的の配列(1.5kbp)をPCRで増幅させた後、P-Blunt→精製→PCI-neoとligationし、HEK293にtransfection(500ng)してウェスタンで確認を試みています。EGFPとcotransfectionし光っているのを確認した後にウェスタンしてます。
templateをpositiveコントロールとしてきちんとバンドが出るのに対し、サンプルはバンドが確認できません。
P-Bluntプレートから別のコロニーを7つとり、7種の「PCI-neo-目的配列」があるのですが、全部発現していませんでした。
ちなみにシークエンシングは問題なく、インサートの方向もあっています(cut check)
よろしくお願いいたします。
 
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(無題) 削除/引用
No.6089-12 - 2017/07/09 (日) 10:46:41 - おお
MluIで繋いだってことは
ACGCGTATG(開始コドン)になっている?コザックとして機能するだろうか?

(無題) 削除/引用
No.6089-11 - 2017/07/09 (日) 08:47:19 - PCR
上に上がっていなかったから返信が無いものだと思って見過ごしてました。

書かれている内容の通りにきっちり出来ているなら、なんら問題無いはずだと思いますが、WBで発現が確認できない以上はどこかで見落としがあるんでしょうね。

1)
>得られたコロニーのうち7つをピックアップ、O/N cultureしminiprep、それぞれをPCI-neoのMluT にligation

これはつまり「pCR-VSVGをMlu Iで切断、VSVG (1.5 kbp)のバンドをゲルから切り出して精製、それをMlu Iで切断済みのpCI-Neoにライゲーションした」ということでいいんですよね?

2)
colony PCRでインサートの方向を確認した後

この時のプライマーセットは、ベクター(pCI-Neo)上のものとVSVG上のものでやりました?T7とVSVG上のものとかじゃないですよね?

3)
pCI-neo-VSVGをMluで切ると、1.5Kbp(VSVG)のバンドが確認できます。

1.5kbpのバンド以外の、バックボーンベクターのバンドのサイズに間違いはないですか?


なにを疑っているかというと、riaさんがpCI-neo-VSVGと思っているものが実際にはpCR-Blunt-VSVGなんじゃないかということです。

(無題) 削除/引用
No.6089-10 - 2017/07/05 (水) 02:57:07 - ria
>またPCR-Blunt-VSVGをMluで切ると、1.5Kbp(VSVG)のバンドが確認できます。

PCI-neo-VSVGの間違いでした

(無題) 削除/引用
No.6089-9 - 2017/07/05 (水) 02:55:08 - ria
>[Re:8] PCRさんは書きました :
> >templateをpositiveコントロールとしてきちんとバンドが出るのに対し、サンプルはバンドが確認できません。
>
> この文章の意味が取れません。
>
> 1)一体何をpositiveコントロールとしたのでしょうか?仰るところの「template」とは?その「template」にどのような操作をしてpositiveコントロールにしたのですか?
>
> 2)サンプルとは?riaさんが作った発現ベクターをtransfectionした細胞のライセートのことでしょうか?
>
> 3)そもそも、そのバンドって何でしょうか?何に対する抗体ですか?その1.5kbpの遺伝子が作るタンパクに対する抗体のはずだとは思うのですが。。。
>
> もう少しきっちりと説明して頂けますか?
>
>
> 初心者のうちは、変な省略をせずにきちんと一つ一つ時系列に沿って(くどいかなと思うくらい細かく)説明した方がいいですよ。でないと色々とミスコミュニケーションがおきますから。


サブクローニングの練習中なのですが、pLP/VSVGからMul-VSVG-FとVSVG-Mlu-Rのプライマーを使い、両端にMluTのついたVSVGをPCR(15サイクル)。PCR産物をアガロースゲル泳動、Gel extraction、PCR-Bluntにligation、transformation、得られたコロニーのうち7つをピックアップ、O/N cultureしminiprep、それぞれをPCI-neoのMluT にligation、colony PCRでインサートの方向を確認した後、正しい向きのコロニーをそれぞれのプレート(VSVG#1~7)からひとつ選びO/N culture、miniprep、その後500ng/eachで12well HEK293にtransfection(Lipo2000、Opti-MEM、4h後にserum入りに交換。PCI-neo-VSVG#1~7、pLP/VSVG(ポジコン)、HEK(ネガコン)すべてPCI-neo-EGFP200ngとcotransfection)。24時間後EGFP発現を確認し、Harvest、WB。という流れです。
PCR-Blunt-VSVG#1〜7をシークエンシング→少なくとも#2,3はあっていることが分かっています #1,2はシークエンスエラーがありました。#5~7はまだ確認していません。
またPCR-Blunt-VSVGをMluで切ると、1.5Kbp(VSVG)のバンドが確認できます。
しかしWBの結果はポジコンのみVSVGがきれいに見えますが、他はすべてなしです。
上司には配列が間違っているとしか考えられないが、それにしても7つもの違うコロニーからとってきたものが全部だめだとは考えにくいと言われました。
細胞染色、mRNAの転写確認等はまだ技術がないためできないです。
開始コドン前後はCGT/ATG/A +4がAとなっています。

限られた情報ばかりですみません。
transfectionはできている、WBの手技も問題ないとすると、
シークエンスエラー、mRNAに転写されない、翻訳されないといったことが考えられる、ということであっていますでしょうか?
知りたいのは、なぜうまくいかないのかの原因を見つけていく作業が初めてで、トラブルシューティングしたいのですが調べても分からずここで尋ねさせていただいた次第です。

(無題) 削除/引用
No.6089-8 - 2017/07/02 (日) 04:43:16 - PCR
>templateをpositiveコントロールとしてきちんとバンドが出るのに対し、サンプルはバンドが確認できません。

この文章の意味が取れません。

1)一体何をpositiveコントロールとしたのでしょうか?仰るところの「template」とは?その「template」にどのような操作をしてpositiveコントロールにしたのですか?

2)サンプルとは?riaさんが作った発現ベクターをtransfectionした細胞のライセートのことでしょうか?

3)そもそも、そのバンドって何でしょうか?何に対する抗体ですか?その1.5kbpの遺伝子が作るタンパクに対する抗体のはずだとは思うのですが。。。

もう少しきっちりと説明して頂けますか?


初心者のうちは、変な省略をせずにきちんと一つ一つ時系列に沿って(くどいかなと思うくらい細かく)説明した方がいいですよ。でないと色々とミスコミュニケーションがおきますから。

(無題) 削除/引用
No.6089-7 - 2017/07/02 (日) 01:18:22 - ria
>[Re:2] みさんは書きました :
> 説明が不十分で状況が把握できませんが。
>
> コザック様配列は付けてあるか(もちろん必須ではないという意見も出るでしょうが)。
> 1stメチオンからSTOPコドンまでを発現させようとしているのか。
> mRNAの転写は確認したのか。
> pCI-neoのベクターは他のコンストラクトでは問題なく発現するのか。
>
> タグに対する抗体または蛋白に対する抗体の検出なのか。
> 抗体その他の方法はWorkしているのか。
> 発現量が少なかったと仮定して免疫沈降での濃縮は無理なのか。
> Westernではなく細胞染色では検出できるのか。
>

みさん、ありがとうございます。
抗体はworkしてます。
メチオンからstopコドンまでです。
mRNAは見てないです
cotransfectionしてるpCI-eGFPは発現しています。
コザック配列、免疫沈降、細胞染色等々恥ずかしながらまだなじみのないwordで、、
もうちょっと勉強します

(無題) 削除/引用
No.6089-6 - 2017/07/02 (日) 01:14:16 - ria
>[Re:5] monさんは書きました :
> pCI-neoに正しくcDNAを挿入出来ている(挿入部位問題なし、塩基配列確認、向き確認)として、plasmidをカラム精製。
> そのうち500ngをEGFP発現ベクター500ngと一緒に35mm dish上のHEK293をlipofection。
> 2日後くらいにEGFP positive細胞が視認出来ることを確認して、細胞をSDS sample buffer 200uLに溶解。
> うち20uLを10% SDS-PAGEゲルにロードして目的タンパクに対する抗体でWB。
> という操作でしょうか?
>

まさにmonさんの書かれているとおりです。ありがとうございます。
書き方が悪く申し訳ありません。
塩基配列が同じと予想されるサブクローンが7種ということです。
どういう表現をしたらいいのかが分からなくて変な日本語になってました、すみません。

(無題) 削除/引用
No.6089-5 - 2017/07/01 (土) 13:16:13 - mon
pCI-neoに正しくcDNAを挿入出来ている(挿入部位問題なし、塩基配列確認、向き確認)として、plasmidをカラム精製。
そのうち500ngをEGFP発現ベクター500ngと一緒に35mm dish上のHEK293をlipofection。
2日後くらいにEGFP positive細胞が視認出来ることを確認して、細胞をSDS sample buffer 200uLに溶解。
うち20uLを10% SDS-PAGEゲルにロードして目的タンパクに対する抗体でWB。
という操作でしょうか?

(無題) 削除/引用
No.6089-4 - 2017/07/01 (土) 13:08:07 - mon
>7種の「PCI-neo-目的配列」
これも意味不明。。塩基配列は同一と予想されるサブクローンが7種と言うことかな?

(無題) 削除/引用
No.6089-3 - 2017/07/01 (土) 13:06:16 - mon
P-Bluntの意味も不明。。
>templateをpositiveコントロールとしてきちんとバンドが出るのに対し
ウェスタンブロットの結果ですよね。この場合template(=PCRの鋳型)って何?PCI-neo以外の発現ベクターをHEK293細胞に遺伝子導入したということ?

(無題) 削除/引用
No.6089-2 - 2017/07/01 (土) 09:40:31 - み
説明が不十分で状況が把握できませんが。

コザック様配列は付けてあるか(もちろん必須ではないという意見も出るでしょうが)。
1stメチオンからSTOPコドンまでを発現させようとしているのか。
mRNAの転写は確認したのか。
pCI-neoのベクターは他のコンストラクトでは問題なく発現するのか。

タグに対する抗体または蛋白に対する抗体の検出なのか。
抗体その他の方法はWorkしているのか。
発現量が少なかったと仮定して免疫沈降での濃縮は無理なのか。
Westernではなく細胞染色では検出できるのか。

ウエスタンでタンパク確認できない 削除/引用
No.6089-1 - 2017/07/01 (土) 02:54:19 - ria
初心者です。いつも勉強させていただいてます。よろしくお願いします。

目的の配列(1.5kbp)をPCRで増幅させた後、P-Blunt→精製→PCI-neoとligationし、HEK293にtransfection(500ng)してウェスタンで確認を試みています。EGFPとcotransfectionし光っているのを確認した後にウェスタンしてます。
templateをpositiveコントロールとしてきちんとバンドが出るのに対し、サンプルはバンドが確認できません。
P-Bluntプレートから別のコロニーを7つとり、7種の「PCI-neo-目的配列」があるのですが、全部発現していませんでした。
ちなみにシークエンシングは問題なく、インサートの方向もあっています(cut check)
よろしくお願いいたします。

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