Bio Technical フォーラム

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HUVECがThrombin刺激で死にかけてしまいます トピック削除
No.611-TOPIC - 2012/06/07 (木) 05:20:32 - 匍匐前進の日々
ファイブロネクチンコートしたガラススライドにHUVECを単層で培養し，それをトロンビン4U/mLで刺激して反応を見る実験をしています．

M199 20%FBS ECGS で育てた細胞を，
M199 1%FBS　グループと，M199 1%FBS with Thrombin(4U/mL)グループに分けて，30分，60分，1時間，2時間のタイムコースでTF expressionを調べます．

しかし30分後には既にトロンビングループで細胞がシュリンクし，みっちりしていた細胞間にがっつり隙間が出来てしまっています．

https://picasaweb.google.com/103837438559955267799/Experiment?authuser=0&authkey=Gv1sRgCNbAudD08c3IDA&feat=directlink

ガラススライドは洗浄，オートクレーブ後にファイブロネクチンコートを1時間してすぐに使用しています．


トロンビンは1K/vialの物をM199で100u/1mLにアリコットして-20℃で保存．これも新しい物を作って試してみましたが結果は同じです．

アドバイスを頂けると非常に助かります．よろしくお願いいたします．
　
　
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(無題) 削除/引用
No.611-5 - 2012/06/07 (木) 18:48:10 - qq
＞知っている人の「こんな物ではないでしょうか？」
申し訳ありませんが、わたしはHUVECを使ったことも、thrombinを受容体刺激に使ったこともありません。
カルシウム動員が起こるのではないですか？そうであれば、細胞の形態が変わりそうです。thrombinは、受容体を切断して活性化するのですから、おそらく受容体のインターナリゼーションなどで、不活性化する仕組みが働きそうです。
形態変化で、細胞のいくつかは剥がれているかもしれませんが、それほど変化していないと思います。視野に1000匹ていどの細胞ですから、写真の細胞数を数えて見ると良いです。

(無題) 削除/引用
No.611-4 - 2012/06/07 (木) 12:19:17 - 匍匐前進の日々
アドバイスありがとうございます．
確かに2時間後，4時間後と回復してきているように見えます．同じアルバムに写真を追加しました．
1人でやっているのでこのまま進んでいいのか駄目なのか，ちょっと確信が持てずに苦心しています．

実験に使われたロットまで確認できないので，ひとまず別のロットを試すこと，トロンビンの濃度を振ること，既知のpasswayの反応を確認してみることにします．

知っている人の「こんな物ではないでしょうか？」の一言が重く感じられます．
何かありましたらよろしくご指導お願いします．

(無題) 削除/引用
No.611-3 - 2012/06/07 (木) 11:34:33 - qq
すばらしいお写真を拝見しました。
＞しかし30分後には既にトロンビングループで細胞がシュリンクし，みっちりしていた細胞間にがっつり隙間が出来てしまっています．
トロンビンの刺激が入っているのでしょ？これでいいのではないでしょうか。
2時間のところでは回復していませんかねぇ？
トロンビンはプロテアーゼですから、トロンビン受容体以外の効果がないとは言えないので、注意が必要かもしれませんね。

(無題) 削除/引用
No.611-2 - 2012/06/07 (木) 10:54:05 - ~
使用しているHUVECやFBSは、元にしている報告で使われているものと同じロットなのでしょうか？
それらのロットが異なれば薬剤への応答濃度が変わってもおかしくないので、トロンビン濃度の検討から始めてはいかがでしょうか。

HUVECがThrombin刺激で死にかけてしまいます 削除/引用
No.611-1 - 2012/06/07 (木) 05:20:32 - 匍匐前進の日々
ファイブロネクチンコートしたガラススライドにHUVECを単層で培養し，それをトロンビン4U/mLで刺激して反応を見る実験をしています．

M199 20%FBS ECGS で育てた細胞を，
M199 1%FBS　グループと，M199 1%FBS with Thrombin(4U/mL)グループに分けて，30分，60分，1時間，2時間のタイムコースでTF expressionを調べます．

しかし30分後には既にトロンビングループで細胞がシュリンクし，みっちりしていた細胞間にがっつり隙間が出来てしまっています．

https://picasaweb.google.com/103837438559955267799/Experiment?authuser=0&authkey=Gv1sRgCNbAudD08c3IDA&feat=directlink

ガラススライドは洗浄，オートクレーブ後にファイブロネクチンコートを1時間してすぐに使用しています．


トロンビンは1K/vialの物をM199で100u/1mLにアリコットして-20℃で保存．これも新しい物を作って試してみましたが結果は同じです．

アドバイスを頂けると非常に助かります．よろしくお願いいたします．
　
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