Bio Technical フォーラム

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凍結切片による蛍光免疫染色 トピック削除
No.6111-TOPIC - 2017/07/07 (金) 19:12:57 - トミー
マウス骨格筋の凍結切片で蛍光免疫染色を行っています。
非特異的なシグナルの原因が分からず、困っています。
プロトコルとしては

15分室温で乾燥
  ↓
10分間4%PFAで固定
  ↓
PBSで洗浄5分間3回
  ↓
15分間1%BSAでブロッキング
  ↓
一次抗体で4℃オーバーナイト
  ↓
PBSで洗浄5分間3回
  ↓
二次抗体で室温30分間
  ↓
PBSで洗浄5分間3回
  ↓
90%グリセリンで封入

という様に行っています。
条件検討を行っていたときにはポジコンがきれいに染まりました。(非特異的なシグナルなし)
それで、実際にサンプルを染め始めると、非特異的なシグナルがたくさんありました。(組織の外にも同じようなシグナルがありました)
封入した直後に観察するとその非特異的なシグナルが動きます。洗浄が不十分と思い、さらに洗浄してみると若干シグナルが減少しました。
また、条件検討で染めたサンプルを試しに洗浄して封入したところ、若干不要なシグナルが増えました。
二次抗体のみ(一次抗体なし)での染色は問題ありませんでした。
ブロッキング時間の検討は行うとしても、この原因が分かりません。
洗浄か封入時に問題があると思うのですが、同じような経験をされた方いましたらアドバイス頂けないでしょうか。
それともタンパク質の非特異的結合はこんなものなのでしょうか、、、
 
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(無題) 解決済み 削除/引用
No.6111-7 - 2017/07/19 (水) 12:04:32 - トミー
皆様、回答ありがとうございました。
試薬類を変えてみたところ改善されましたのでおそらくごみだと思います。

(無題) 削除/引用
No.6111-6 - 2017/07/11 (火) 10:02:27 - PD
条件検討の時はうまく染まっていたということで、一応念のためバファーや試薬類にカビなど混ざっていないかみてみてはどうでしょう。最近暑いので、そういうこともありえるかなと。

(無題) 削除/引用
No.6111-5 - 2017/07/08 (土) 03:55:18 - おお
最近はオートで調整されてしまうので、ネガティブの場合バックグランドが検出されてしまうほど感度が上がっているのに気がつかないということが結構あると思います。もしポジコンがあるのなら、それを使った時にベストの条件(露光時間など)を基準にするといいかと思います。

もし、シグナルがかぶっているという可能性を考えるとフィルターは何を使っているのか、適切なのかということも考えないと行けないかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.6111-4 - 2017/07/07 (金) 20:11:08 - トミー
他の波長でも光りますが、露光時間をそろえると片方のフィルターでは激減します。
確かに雑粒子の可能性はありますね。
ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.6111-3 - 2017/07/07 (金) 19:39:10 - AP
非特異的シグナルといってるけど、本当に二次抗体の蛍光が光っているんですか? 
蛍光でなくて雑粒子が励起光を散乱してるだけだったりしない?
その蛍光色素にあったフィルターでだけのみ見えて、他の波長では光りませんか?

(無題) 削除/引用
No.6111-2 - 2017/07/07 (金) 19:30:52 - トミー
加えて質問です。
二重染色を行っていますが、二次抗体の蛍光強度が異なるということは問題ありでしょうか?
Alexa Fluor 488と555を使っており、露光時間を合わせないと色が重なってしまいます。(露光時間が同じであれば蛍光漏れが起こらないことは確認済み)
555の方が同じ488と露光時間だとバックグラウンドが高く、555の方の露光時間を短くしなければなりません。
近くに詳しい人がおらず、表現も合ってるのか分からないのですが、ご指摘があればよろしくお願い致します。

凍結切片による蛍光免疫染色 削除/引用
No.6111-1 - 2017/07/07 (金) 19:12:57 - トミー
マウス骨格筋の凍結切片で蛍光免疫染色を行っています。
非特異的なシグナルの原因が分からず、困っています。
プロトコルとしては

15分室温で乾燥
  ↓
10分間4%PFAで固定
  ↓
PBSで洗浄5分間3回
  ↓
15分間1%BSAでブロッキング
  ↓
一次抗体で4℃オーバーナイト
  ↓
PBSで洗浄5分間3回
  ↓
二次抗体で室温30分間
  ↓
PBSで洗浄5分間3回
  ↓
90%グリセリンで封入

という様に行っています。
条件検討を行っていたときにはポジコンがきれいに染まりました。(非特異的なシグナルなし)
それで、実際にサンプルを染め始めると、非特異的なシグナルがたくさんありました。(組織の外にも同じようなシグナルがありました)
封入した直後に観察するとその非特異的なシグナルが動きます。洗浄が不十分と思い、さらに洗浄してみると若干シグナルが減少しました。
また、条件検討で染めたサンプルを試しに洗浄して封入したところ、若干不要なシグナルが増えました。
二次抗体のみ(一次抗体なし)での染色は問題ありませんでした。
ブロッキング時間の検討は行うとしても、この原因が分かりません。
洗浄か封入時に問題があると思うのですが、同じような経験をされた方いましたらアドバイス頂けないでしょうか。
それともタンパク質の非特異的結合はこんなものなのでしょうか、、、

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