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(無題) 削除/引用 No.6118-6 - 2017/07/13 (木) 09:21:58 - さがん https://www.nucleics.com/DNA_sequencing_support/DNA-sequencing-troubleshooting.html

(無題) 削除/引用 No.6118-5 - 2017/07/12 (水) 11:43:55 - mon 鋳型量の許容範囲は、PCR産物の方が広いですね(最適量のx1/5~x5でもOK、plasmidの場合はｘ1/3~x3程度かな）。 またGC-richなplasmidの場合、読めない〜波形データが長く取れないことが多いですが、関係無いところで制限酵素で切断すると長く読めるようになります。変性効率が上がるからと思っています。

(無題) 削除/引用 No.6118-4 - 2017/07/12 (水) 09:43:47 - AP センセが言うてはった、だけで実験進めてますか？ ちゃんと、製品マニュアルを読んでますか（ABIのBigDyeでしょうか）。 今の時代、マニュアルはネットで公開されていて、簡単に入手できますものね。 大体、サンガー法なんてプラスミドを読むというのがオリジナルだし、いまでもそのほうが需要が高いんじゃないかしら（コンストラクトの確認など）。 マニュアルを見てPCR産物とプラスミドで異なるのは鋳型の重量ベースの要求量ですが、それを満たしているでしょうか？ベクターの分、分子量が大きくなりますから、コピー数を同程度にするには重量では多くする必要があります。おそらくプラスミドのほうが解離しにくく有効な鋳型となる割合も低くなるので、多めにする必要があるだろうし。 マニュアルにはプラスミドの精製度もうるさく言っていますが、経験上、その点はあまり気にしなくても大丈夫。ボイル法や塩析・エタ沈だけで精製したアルカリSDS法で、RNAが残っているようなプラスミドでも読める。

(無題) 削除/引用 No.6118-3 - 2017/07/12 (水) 08:44:20 - seventh 波形データを見ればある程度原因は推測できるので、まずはそちらを確認してみて下さい。

(無題) 削除/引用 No.6118-2 - 2017/07/12 (水) 07:12:08 - 中年 プラスミドがそれなりにきれいで、お使いのキットのプロトコルに沿ったプラスミド量を使えば、失敗することはまずない実験だと思います。

プラスミドのシークエンス 削除/引用 No.6118-1 - 2017/07/12 (水) 01:36:25 - ピスケ ヒトゲノムの一部をシークエンスする際はPCRをしてサイクルシークエンスをしてキャピラリーシークエンサーにかけます。 しかし、プラスミドをシークエンスする際はPCRをしなくても直接プラスミドをサイクルシークエンスにかければいいと先生に習いました。 しかし、何度もやっていますが読めません（たまーに成功しているサンプルもあります） 一度M13プライマーでPCRすると上手くいきますので、手間ですが毎回PCRをかけるようにしています。 みなさんはプラスミドのシークエンスの際、どのようにされていますか。 上手くいくプロトコール等ありましたら 教えていただきたく思います。

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