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細胞を凍結保存方法(PDL) トピック削除
No.6132-TOPIC - 2017/07/18 (火) 18:52:40 - マノラス
バイオ技術初心者です。

今、ヒト正常皮膚線維芽細胞を培養しており、そのフローは簡単に言うと

細胞解凍→培地交換→継代↓→凍結保存
            RNA抽出

という形です。
ここで凍結保存という工程がありますが、この際に求めるPDLがどのようにして求められるのか、
凍結保存液でセルバンカーを使用したとき、どのように細胞とセルバンカーを混ぜ合わせたらいいのかわかりません。。。

どなたかご教授願います。
 
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(無題) 削除/引用
No.6132-5 - 2017/07/22 (土) 00:36:57 - PDLs
例えば、100%コンフレンシーに達した10-cm dish1枚の細胞を10-cm dish2枚に等分して継代培養し、やがてこの2枚のdishが100%コンフレンシーに達したとき、50%→100%で、この細胞は1PDL進んだ(平均してみたら細胞が1回分裂して数が2倍になったとみなす)ことになります。もし4枚のdishに等分したならば、25%→50%→100%でそれぞれが100%コンフレンシーになったとき、もとのdishからは2PDL進んだことになります。細胞一つ一つが何回分裂したかが正確ですがそれを知ることは現実的には困難なので、細胞集団として2倍になったことをもって、それを構成する細胞1個もとりあえず平均すれば1回分裂したものとみなすとう約束事ができました。
初代培養細胞を扱う人の間では継代数で言うひとも多いですが、その人がどういうルールで継代しているかで話が変わってくるのでPDLで記録するのが良いと思います。
初代培養細胞を購入すると細胞の面積で最大どのくらいまで増やしても性質を保証しますなどの情報があるとおもいます。それから逆算してどのくらいのサイズのdishでなら何PDLまでOkとか見積もれます。

(無題) 削除/引用
No.6132-4 - 2017/07/21 (金) 15:18:02 - mon
セルバンカーは、遠心して上清を取り除いた細胞塊をセルバンカーで懸濁します。1plusとか2を汎用しています。
なので濃縮というのは?2xとか売ってましたか?
なお、セルバンカーに懸濁した状態で1x10^7cell/mLとなっていても問題なかったです(2x10^7cell/mLでもいけたような。。)。濃いめにしている理由は、たとえ生存率が10%になっても何とか復活できるようにと思ってです。クライオチューブに0.5mL~1mL分注して出来るだけ早く(細胞が沈殿する前に)紙箱等で-80℃で凍結>そのまま、あるいは液体窒素で保存しています。-80℃保存でも奥の方にいれて扉の開閉による温度上昇を避ければ5年は持ちました(最近は停電が怖い。。)。

(無題) 削除/引用
No.6132-3 - 2017/07/21 (金) 14:18:06 - マノラス
そうですよね・・・
後手寧にありがとうございます。

差し支えなえなければもう一つ伺いたいのですが、
細胞数というのは数えて平均を出すことはできるのですが、
状況に応じて、場細胞懸濁液は再度遠心をかけて濃縮してもいいんですよね?
(セルバンカーは5×10の5~6乗 の範囲の細胞数で1ml加えるとあるので)

(無題) 削除/引用
No.6132-2 - 2017/07/18 (火) 22:51:45 - mon
セルバンカーは説明書を読んでください。Netでも探せるでしょう。
基本はトリプシン処理して遠心回収した細胞を直接セルバンカーで懸濁します。
PDL(の計算法)も判らないで寿命のある正常細胞を扱うのはマズイですよ。
細胞数(密度)の計数は出来ますか?基本は細胞数が2倍になればPDLは+1です。
方法はNetでも探せるでしょう。例えば
http://www.saibou.jp/service/word01.php
ちなみに上記HPで3.33=1/log 2です。

細胞を凍結保存方法(PDL) 削除/引用
No.6132-1 - 2017/07/18 (火) 18:52:40 - マノラス
バイオ技術初心者です。

今、ヒト正常皮膚線維芽細胞を培養しており、そのフローは簡単に言うと

細胞解凍→培地交換→継代↓→凍結保存
            RNA抽出

という形です。
ここで凍結保存という工程がありますが、この際に求めるPDLがどのようにして求められるのか、
凍結保存液でセルバンカーを使用したとき、どのように細胞とセルバンカーを混ぜ合わせたらいいのかわかりません。。。

どなたかご教授願います。

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