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(無題) 削除/引用 No.6141-11 - 2017/11/26 (日) 02:52:23 - たいぞう このトピックにお返事を下さった皆様、有難うございました。 時間が空いてしまいましたが、お返事いただいてから、この訳の分から似状況を解明すべく、クローニングというものをしました（外注）。 その結果、発病個体に関して、2か所のSNPに対し、アレルが4つあることが分かりました。ホモ個体もあったことから、これが翻訳過程での異常事態なのか知るために、ゲノムDNAの解析をしています。 幸い、データベースからDNA配列が分かりましたが、DNAの収量が上がらず、またも解析以前のことで苦労しています。 とりあえず、このトピックは閉め、別に質問させていただきたいと思います。 本当に有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.6141-10 - 2017/07/24 (月) 02:36:16 - たいぞう おお様 　病気の原因ではなく結果、というご見解に私も同感です。 哺乳類では、正常血清中の当該蛋白質はマクロファージで除去されるようです。 それで、分解が進まないから濃度が上がって沈着する、という説があり、それに関しては、マクロファージ側の変異、分解を促進する環境（ｐHなど）の変化（環境が異常なために分解酵素などの活性が落ちる）など、が検討されているようです。 ただ、それを検討するにも鳥では分かっていないことだらけで途方にくれます・・・。 AP様 　RNA editing...こういう現象があるとは知りませんでした（これに限らず、知らない事の方が圧倒的に多いのですが・・・）。 ジェノタイピングもやったことがないのですが、やるにはゲノムDNAでの当該蛋白質の遺伝子領域が分からないとダメということですよね・・？ Dynabeadsを使ったのは、ゲノムDNAからのスプライシング作業が難しすぎて、私には出来ないと思ったからです・・・。 スプライシング前の、ゲノムDNAの領域を、ｍRNAから逆に辿っていくことってできるのでしょうか？理論的には出来そうですが…もっと難しそうで・・・。 私の中での問題は、 ヘテロはQとRの2種類の蛋白質を作るはずだが、沈着する蛋白質はRだけなので、Qの沈着を阻害する何ががあるのかもしれない、（という所までは分かりました）が、ではQしか持っていないホモの個体は沈着しないはずだと思うが実際は沈着した個体がいる、これはなぜなのか？ ということであります。 ヘテロだと働く何かが、ホモだと働かないと解釈することも出来そうですが、そうなるとQのホモで沈着したたんぱく質はRではなくてQだったのかな・・と。これはホモで沈着した蛋白質を解析できなかったので何とも言えないのですが・・。 解析できていないんだから悩んでも無意味、と思うのですが、Qを作る遺伝子しか持っていないのに、Rの蛋白質が沈着する現象というのが、もし、あるなら知りたいと思いました・・。 ＿様 沈着蛋白質の話はLC-MS/MSでのことです。 外部の研究者にやっていただいた解析で「Rしかない。Qは全く無い」と報告を受けています。 何回かやり直していただいた結果なので間違いはないと思います。

(無題) 削除/引用 No.6141-9 - 2017/07/23 (日) 15:46:53 - ＿ RとQの量比の話はLC/MSの結果から言っているのですよね？ Rのペプチドはイオン化効率が良く検出感度が高いのに対し、Qの入ったペプチドは効率が悪く感度が悪いだけだという可能性はないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6141-8 - 2017/07/23 (日) 10:26:01 - AP 問題点を私なりに整理したんですが、 タンパク質レベルでの話は、Q型は正常に代謝されるがR型は臓器に異常沈着する、ということで矛盾はないわけですね。 問題は、遺伝子(ゲノム？、cDNA?)の塩基配列との食い違いということでいいですか。 先にあげたRNA editingのような現象もあるし、ちょっと違うけどプリオンみたいな例もありますし。 何か面白そうな現象のようですね。

(無題) 削除/引用 No.6141-7 - 2017/07/23 (日) 08:16:11 - AP まだ消化しきれてないけど、RNA editingの可能性は？ ホモ接合とかヘテロ接合と言っているのは、ゲノムDNAでもgenotypingしてるんでしょうか。 RとQではどんな塩基置換が起こっていますか？ RNA editingのパターンに一致してませんか？

(無題) 削除/引用 No.6141-6 - 2017/07/23 (日) 01:53:55 - おお 後で詳しく書きますが、その沈着は病気の原因ではなくて結果なのかもしれません。要するになにか違う要因で病気が発生しその結果その解析している蛋白が沈着するが、蛋白発現が低いと病気は発症するけど、沈着は起こらない。 どの程度その遺伝子と病気の関連が示されていますか？その遺伝子にオーバーラップして違う遺伝子（蛋白だけじゃなくってその他機能的なRNAなども含めて）がコードされていませんか？

(無題) 削除/引用 No.6141-5 - 2017/07/22 (土) 23:48:14 - たいぞう AP様 ご丁寧なお返事を有難うございます。 ある疾患で発現する蛋白質と書きましたが、発現という言葉の使い方を間違えました。正常でも発現してる蛋白質です。しかし、発病すると、正常では分解される蛋白質が臓器に沈着して、臓器の機能障害を引き起こします。 蛋白質のアミノ酸配列は、この蛋白質が沈着している部分を切り出して、SDS-PAGEで蛋白質を分離後、ゲル切り出しして、外部の研究者の協力を得て、LC-MS/MSという方法で配列の同定をしていただきました。解析できなかったものは、SDS-PAGEでバンドがほとんど出なかった個体で、沈着量が少なすぎるからだと言われました（この鳥がホモだったのです）。 塩基配列の方は、NCBIの近縁種のデータベースから、この蛋白質を作るｍRNAの予測配列を元にプライマー設計をして、PCR産物をシーケンスしました。 （この時、収量が少なくて困り、濃度を上げる方法を質問させていただき、AP様からPCR産物をもう一度PCRにかけることを教えていただきました。本当に助かりました。この場を借りて御礼申し上げます。） ｍRNAは、Dynabeadsを使って直接抽出する方法を取りました（ゆえに、スプライシングの作業をしていません）。ｍRNAからRT-PCRを行い、ｃDNAでPCRをかけています。 異常蛋白（沈着蛋白）のアミノ酸配列と、この塩基配列の翻訳後のアミノ酸配列が一致したので、この遺伝子が沈着蛋白質を作っていると判断しましたが、発症していない鳥の遺伝子も同じなので、沈着するかしないかは、遺伝子側ではなくて何か別の因子が作用していると考えています。 発症して異常蛋白の沈着が確認された鳥の遺伝子には、ヘテロ（QとR）もあればホモ（Qのみ）もあったのですが、沈着しているタンパク質はRのみだったので、Qはどうしちゃったのだろう？、と疑問に思ったわけです。 ホモで発症した鳥の異常蛋白が、もしQの蛋白質であったなら、沈着蛋白が2種類あるということになると思いますが確認できませんでした。 しかし、もし、蛋白はRのみであったら、Qなのに沈着する時はRになってしまうのはなぜなのだろう、と思った次第です。 正常個体も作っている蛋白質ですから、血清中に存在している状態の蛋白質を解析する（QとRそれぞれの蛋白質発現量）必要があると思うのですが、方法が分かりません・・・。 RNAの発現量を見る、というのはリアルタイムPCRでみるということでしょうか？ 遺伝子の発現量と、作られる蛋白質の発現量は、必ずしも一致しないと聞いていたのですが・・・・。 両アリルは、塩基置換のみの違いです。長さも同じです。構造まではよく分かりませんが、既報の2次構造とアミノ酸の配列は一緒です。 こんな説明でお分かりいただけましたでしょうか・・・。 ご教授いただければ幸いです。 どうぞよろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.6141-4 - 2017/07/22 (土) 13:45:12 - AP 実際分かりにくくて、ちょっとロジックが追えないところがあるんですが、 >ある疾患で発現するタンパク質のアミノ酸配列と、それをコードする遺伝子の塩基配列が分かりました。 これは何からわかったんですか？　アミノ酸シークエンスをしたということですか？　塩基配列はゲノムDNA配列ですか、cDNAですか？ >しかし、遺伝子に2か所のSNPがあり、少なくとも二つのアレルがあることが分かりました。 2か所のSNP（ヘテロ接合部位）の一か所は、翻訳後も同じアミノ酸なので問題ないのですが、もう一か所は2種類のアミノ酸（RとQ）に翻訳されるはずなのですが、 と書いてあるのに、 >発病して病的蛋白を作った個体も、病的蛋白を作らない正常個体も、遺伝子は同じなので、遺伝子異常で発病するのではなさそうだと分かりました。 となるのはなぜですか？ >Qのみをコードするホモ接合の個体も発症し、 ホモ接合体「も」と書いてあるということは、ヘテロ接合体も発症すると言外にいっているのでしょうか？ >病的蛋白を作っていますが発現量が少なすぎて解析が出来ませんでした。 病的タンパク質を作っているということは何からわかったんですか？　少なすぎて出来なかった解析とはなんですか？ また両アリルは塩基置換だけしか違いがないんですか？　 RNAの発現量は見ていますか？　そもそもQアリルは転写産物の時点で量が少ないということはありませんか？ あるいは、RNAの長さなど構造に違いがあったりしないですか？　Northernなどで解析する必要があると思いますが。 ヘテロ接合でも発症するなら、可能性としておおさんが挙げているHaploinsufficiencyもありますが、ほかにanitmorph (言い換えるとdominant negative)ということも考えられます。 量が少ないとしても異常なタンパク質が存在することで正常なタンパク質の機能も妨げられる場合です。 単純な例としては、ホモ多量体を作って機能するタンパク質で、異常なタンパク質が混じると機能が阻害されるような場合。身近なところでは酒に対する強さに関係するALDH2のように。

(無題) 削除/引用 No.6141-3 - 2017/07/21 (金) 03:28:51 - たいぞう おお様 いつも深夜にもかかわらずお返事を有り難うございます！ お返事の内容について調べておりましたが、付け焼き刃で対応できるものでもなさそうなので、しっかり理解できるように調べてみます。 本当にいつも有り難うございます。

(無題) 削除/引用 No.6141-2 - 2017/07/21 (金) 00:58:09 - おお Qになる場合ですが、遺伝子の配列の変化はタンパク質のアミノ酸変化だけでなく、スプライシング（とそのけっかによるNMD)、mRNAの安定性、翻訳効率、蛋白安定性など様々なものに影響する可能性があります。特に蛋白の安定性以外は、アミノ酸が変わらなくても塩基配列が変われば起こる可能性があります。 遺伝病の発症のメカニズムにhetero insufficiencyというのがあり、変異がある遺伝子が何らかの理由で発現せず、量的に不足して発症するという病気もあるようです。

ヘテロ接合　発現蛋白は一種類 削除/引用 No.6141-1 - 2017/07/21 (金) 00:42:06 - たいぞう いつもお世話になります。 鳥なのですが、ある疾患で発現するタンパク質のアミノ酸配列と、それをコードする遺伝子の塩基配列が分かりました。 発病して病的蛋白を作った個体も、病的蛋白を作らない正常個体も、遺伝子は同じなので、遺伝子異常で発病するのではなさそうだと分かりました。 しかし、遺伝子に2か所のSNPがあり、少なくとも二つのアレルがあることが分かりました。 2か所のSNP（ヘテロ接合部位）の一か所は、翻訳後も同じアミノ酸なので問題ないのですが、もう一か所は2種類のアミノ酸（RとQ）に翻訳されるはずなのですが、検出される異常蛋白質はRの一種類のみです。 Qのみをコードするホモ接合の個体も発症し、病的蛋白を作っていますが発現量が少なすぎて解析が出来ませんでした。 病的蛋白に2種類あるとは考えにくいのですが・・。 どう解釈したらよいのでしょうか？ 分かりにくい文章かもしれませんが、ご意見いただければと思います。 どうぞよろしくお願い致します。

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