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(無題) 削除/引用 No.618-10 - 2012/06/09 (土) 13:56:51 - アレクサ うーむ 様 回答ありがとうございます。 みなさんのお話を総合してみても，やはりCCDカメラを通した観察が必要みたいですね。 緑色と赤色filterはすでに検出するタンパクでうまっているため，残る350と647を使用したいと考えているのですが，理論上は可能でも実際は難しいようですね。 何か漏れ込みが少なく，明るい色素があればよいのですが， Cy5とAlexa647を比較してもCy５は肉眼観察が不可能だったため，Alexa647を採用しております。 何かCy5 filterで観察可能なAlexa以外の明るい色素はありませんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.618-9 - 2012/06/09 (土) 13:20:15 - うーむ Alexa 350も肉眼では見えにくいと思います。 また退色が早かったような記憶が・・・。 Alexa 350もAlexa 647も、 蛍光波長は、理論上は可視光の範囲内だからと思っていても、 肉眼で明暗を判断するには、いかんせん蛍光強度が足りないみたいです。 核とタンパク１・２・３、などといった４重染色をしたい場合は、 ＣＣＤカメラと、適切なフィルターセットが必要になります。

(無題) 削除/引用 No.618-8 - 2012/06/09 (土) 12:50:28 - アレクサ 虫の息 様，Mfe様 回答有り難うございます。 現在のところ，Cy5 filterを使用した観察は肉眼でできています。 ただこれは，抗体が優秀？であり，過剰量の抗体を使用しているからだと思います。ですので，コスト面で非常に現実的ではない状態です。 過剰量だからこそ，漏れ込みも多いのかもしれないですね。 フクロウでない限り無理とのこと。。。笑。 相当無理な系なのですね。 他にAlexa 350を使用したのですが，全体的にバックグラウンド？なのでしょうか，全体的に青白くみえ，コントラストがついておらずに観察しづらい状態です。 肉眼での観察を考えるとこちらに変更したほうが無難でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.618-7 - 2012/06/09 (土) 11:28:58 - Mfe それは、フクロウでもない限りは、普通の人類には難しいでしょう。CCDでだめ、というところを解決するか、他の色素系を考えるか、した方が賢明です。

(無題) 削除/引用 No.618-6 - 2012/06/08 (金) 18:06:01 - 虫の息 肉眼の判断にCy5はきつくないですか

(無題) 削除/引用 No.618-5 - 2012/06/08 (金) 17:09:50 - アレクサ Mfe様 回答有難うございます。 確かに画像を得るためだけであれば，そのような方法でも十分そうですね。 とある事情のため，CCDカメラを通しての判断ではなく，肉眼で見て染め分けができることが必要とされています。 そのため，もともと見えにくい647の蛍光を強くせざるを得ない状況です。 この実験系自体は無謀なのでしょうか…？

(無題) 削除/引用 No.618-4 - 2012/06/08 (金) 17:01:09 - アレクサ Q様 回答有難うございます。 もちろん何も染めていない時については確認済みで，光っておりません。

(無題) 削除/引用 No.618-3 - 2012/06/08 (金) 16:51:45 - Mfe 波長特性を見られればわかるように、どのフィルタでも漏れこみはゼロにはならないわけで、強い647のシグナルがあれば、RFPフィルタでも見えます。肉眼で見えなくてもCCDのゲインをあげれば撮れます。普通は、濃度を調節して、crosstalkがおきない範囲を決める必要があります。この場合は、赤を強めて647の濃度を下げればすむのでは？

(無題) 削除/引用 No.618-2 - 2012/06/08 (金) 15:05:20 - Q まさか、何も染めていないときにも光っているとかはないですよね？

Alexa647を使用した免疫染色について 削除/引用 No.618-1 - 2012/06/08 (金) 14:55:05 - アレクサ 現在，Alexa647を二次抗体に使用し，免疫染色を行なっています。 染色を行った結果，Alexa647をdetectできるCy5用フィルター（オリンパス/u-dm3-cy5）でシグナルを検出することができたのですが，RFP用フィルター（オリンパス/u-mwig3）へ蛍光の漏れ込みがおこっていました。 RFP filterがロングパスだったことから，バンドパス（オリンパス/u-mwiga3）に切り替えて観察を行なってみましたが，多少漏れ込みが弱くなったものの，劇的な改善は認められませんでした。 このような場合，何が起こっていると考えればよいのでしょうか。 また改善点としては何かありますでしょうか。 現在はsingle stainingですが，今後多重染色を考えており，RFP filterを使用したいので困っております。 ご意見いただければ幸いです。

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