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(無題) 削除/引用 No.6195-6 - 2017/08/09 (水) 13:47:04 - 駆け出し大学院生 AP>マニュアルの読み込みが足りませんでした。有難う御座います。私が70℃でincubateといっていたのは「Generate a single-stranded 10 nucleotide ladder」の項目でした。 その他も、解説頂き誠に有難う御座います。 おお>解説頂き、有難う御座います。大変勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.6195-5 - 2017/08/09 (水) 07:34:25 - AP リンク先の10 bp ladderの注意書きには、加熱するなって書いてありますね。 短い二重鎖はTmが低いので穏和な加熱でも解離してしまうため、特に注意をしているのです。 DNAの酵素処理後に酵素を失活させる目的で60-70℃程度で加熱することはあります。 lambda phage DNAの制限酵素消化物を利用したDNAマーカーの場合は、lambda phage DNAの両端にあるcos siteというのが十数塩基の付着末端であるため、保存中にアニールしてしまうことがあります。そのため、使用前に60℃程度の穏和な加熱をします。

(無題) 削除/引用 No.6195-4 - 2017/08/09 (水) 00:43:11 - おお 通常２本鎖のDNAで、長さを見るための電気泳動なら加熱処理は入りません。DNAの場合はそれにSDSをつけるわけでもなく、長さあたり一定のリン酸による負電荷が存在しますので。 マーカーはλHindIIIなどは、DNAの末端の突き出たところがアニーリングして２本のDNAがあたかも１本のように振る舞ったりするので、２本鎖を乖離しないほどの加熱を行うといいと言われています。λHindIIIを使っているわけではないかもしれませんが、マーカーの方に事情があるのでしょう。同様にあなたのサンプルも２本鎖を乖離しない程度の熱処理は可能ですけどね。 温度については、ちょっと長いプライマーならTmが６０度を超えますので、、、 また、DNAを１本鎖にして流すという実験もあることはあります。この場合は加熱をします。ゲルに尿素などを加えたりして流します。

(無題) 削除/引用 No.6195-3 - 2017/08/08 (火) 23:45:37 - 駆け出し大学院生 APさん> なるほど。確かにその通りです。。。 DNA Ladderのプロトコール（下記）では、70度で5分incubateしています。。。70度だったら２本鎖には分かれない（？？）からいいのでしょうか。。。 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10821015 いずれにせよDNAsampleに対しては不要ですかね。。。有難うございます。 研究室にはあまり相談できる人がいないんです。。。ウェスタンプロット等一般的なものでしたら、対応はしてくれるのですが、、、なにせしっかりとした基礎の研究室ではないので。。。

(無題) 削除/引用 No.6195-2 - 2017/08/08 (火) 22:09:25 - AP 不必要、というかやっちゃいけないやつだ。 DNAをSDS-PAGEのサンプルのように加熱したら一本鎖に解離して、かえって二次構造をとって、移動度がむちゃくちゃになるだろが。 スーパーバイザーはおらんのか？

電気泳動(PAGE)の前のsampleの処理 削除/引用 No.6195-1 - 2017/08/08 (火) 21:57:25 - 駆け出し大学院生 SDS-PAGEのタンパク質の電気泳動の際には、sample bufferと混ぜ合わせた後に、加熱が必要とあります。 熱処理は、タンパク質の高次構造をできるだけ破壊し、SDSを結合させる（ポリペプチドの長さに対して一定量のSDSが結合する）とともに、夾雑するプロテアーゼを失活させるためと言われています、とあります。 現在PAGEを用いたDNA( 30-500bp程）の電気泳動を行おうとしているのですが、この際にはsample bufferと混ぜ合わせた後に、加熱は必要なのでしょうか。。。 DNA Ladderと一緒に流すのですが、DNA Ladderはsample bufferと混ぜ合わせた後に、加熱処理するとDNA Ladderの説明書プロトコールに書いてありました。。。 PAGEに関する記載が、あまり見当たらず困っております。。。 ご教示頂けると幸いです。 因みに、XCell SureLock® Mini-Cell (invitrogen)という泳動装置を用いての電気泳動で ・Novex® TBE Gels, 10%, 15 well (Gel thickness 1.0mm) ・Novex® TBE Running Buffer (5X) ・Novex® Hi-Density TBE Sample Buffer (5X) を用います。

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