BioTechnicalフォーラム [ウエスタンブロッティングの標準化について]

ウエスタンブロッティングの標準化について

No.6198-TOPIC - 2017/08/09 (水) 16:32:00 - HARA

現在、とあるたんぱく質に対しウエスタンブロッティングを行っています。
サンプルは細胞質抽出物と、細胞膜抽出物を用いています。　

内在性コントロールとして
GAPDHを標準化に使っているのですが、GAPDHは細胞質に局在しているそうで、
細胞膜抽出物では、発現が見られませんでした。
（目的タンパク質のバンドはどちらの抽出物サンプルでも見られます。）

このような場合、何かうまく標準化する方法はあるのでしょうか？
それとも別のコントロール(βアクチンなど)を使うしかないのでしょうか
研究室にはGAPDH抗体がもともとあったのでできればこれを使いたいと思っています。

何かアドバイスありましたら是非よろしくお願いいたします。
　

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No.6198-6 - 2017/08/10 (木) 01:18:45 - おお

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3614345/

See Other options for internal reference controls

(無題)

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No.6198-5 - 2017/08/10 (木) 01:15:30 - おお

https://www.scientistsolutions.com/forum/protein-detection-western-blots-gels-ip-western-blotting/membrane-loading-control-western-blot
http://www.abcam.com/primary-antibodies/loading-control-guide

コントロールなどとの比較なら、タンパク量であわせるのも手かと思います。その時はトランスファーのあとのニトロセルロースなりPVDFなりをPonCeauなどで染め、同等の量のローディングであることを示すのも手です。もちろんPonCeauの染まり具合を定量してもいいですけど。

(無題)

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No.6198-4 - 2017/08/09 (水) 21:12:27 - I

In our lab, Na-K-ATPase is used for marker of plasma membrane.

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No.6198-3 - 2017/08/09 (水) 16:50:32 - AP

それかて、それぞれの画分の総タンパク質量に標的タンパク質が占める割合を比較するということになっても、絶対量の比較は出来んわなあ。膜画分と細胞質画分でそもそも総タンパク質量が全然違うから。

(無題)

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No.6198-2 - 2017/08/09 (水) 16:46:59 - AP

標準化というのは膜画分と細胞質画分でということでしょうか。
つまりイメージとしては両画分で同じくらいに存在しているはずのタンパク質を内部標準にとりたい、というようなこと？
無理です。
総タンパク質量を慎重に定量して、ロードタンパク質総量が同じになるようにするくらいしかないんじゃない？