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(無題) 削除/引用 No.6201-14 - 2017/08/16 (水) 14:54:30 - ふむふむ PDさん マニキュア使っていなくても数日たつとバックグラウンドが上がるんですね ただ私の場合、数十分単位で明らかにバックグラウンドが上がってしまったんですよね・・・ 1枚目はちゃんと観察できたのに、2枚目のスライド見たら、あれ？バックが高いぞ？もう一度1枚目見てみよう→あれ？さっきより観察しづらい って感じになりました。 slowfadeとマニキュアやcovergripの相性が悪くて、さらに24穴用のカバーガラスだからより影響を受けやすかったのかな？とも思っています

(無題) 削除/引用 No.6201-13 - 2017/08/16 (水) 09:29:30 - PD わたしもSlowfadeを使用していますが、マニキュアを使用しなくても時間が経つと（数日〜）緑のバックグラウンドが上がってくる印象です。PBSで洗うと下がるので、試薬自体の自家蛍光？なんですかね。

話がそれてしまいますが・・・ 削除/引用 No.6201-12 - 2017/08/15 (火) 14:32:44 - ふむふむ マニキュアでバックグラウンドが上がって、観察しづらくなったことならあります。赤色蛍光には影響無かったのですが、緑色蛍光での観察は、時間経過とともに、徐々に困難になっていきました。 それ以来封入剤は固化するタイプ（prolong系）を使っています KSRさんのおっしゃっているシールド専用試薬も試してみたのですが（cover grip）これでも結局、緑色蛍光は徐々に観察しづらくなってしまいました。 この製品のHPにもマニキュアは緑色蛍光での観察がしづらくなることがあると記載してあったのですが、私以外に同じ経験をした人が身近にいないのがとても不思議でして・・・ その時使っていたのはslowfadeなんですが、同じ経験されたかたいませんか？ もしかしたらマニキュアor cover gripの量が多すぎたのか、逆に、全周囲を覆えてなくて乾燥させたのが原因なのかな？と思っています。 細胞は24穴プレート用のカバーガラス上で培養していますので、面積比？体積比？的にマニキュアやcovergripの影響を受けやすかったのでは？とも思っているのですが・・・

(無題) 削除/引用 No.6201-11 - 2017/08/12 (土) 10:26:00 - AP マニキュアの影響というのは興味があるな。 マニキュアで封じる前と後、両方で検鏡して比較してみたらどうですか。 樹脂だけじゃなく、溶媒のアセトンなどの影響も考えられます。 GFPなど蛍光タンパク質は有機溶媒で消光するので、マニキュアで封じると浸透した溶媒で蛍光強度が下がるということは言われています。 蛍光抗体で強度が上がるなら、逆にエンハンサーとして応用できるかも。

(無題) 削除/引用 No.6201-10 - 2017/08/12 (土) 10:14:04 - Tracker 私も同じような方法でマウントしていますよ。マウント剤はただの90% glycerol/PBSです。 マニキュアが浸みて強く光っている部分は明らかに判別できるので、辺縁部ではほとんど観察していません。 当然観察できる範囲は狭くなりますから、それで困る場合にはKSRさんの仰っているように固化するタイプのモノを使うのが良いと思います。 私は界面活性剤は膜透過処理の際しか入れていません(0.1%TritonX100 5min r.t) アルコール固定の際にはそれも省いていますね。 ブロッキング液、抗体希釈液は一貫して1%BSA/PBSです。 MeOH固定って、MeOHを結構冷やしとかないと細胞の形態が変わっちゃった記憶があります。

(無題) 削除/引用 No.6201-9 - 2017/08/11 (金) 21:59:44 - KSR >確かに強く光っているところはマニキュア越しに見ていたのかもしれせんね。。 >ちなみにアイソタイプにはそのような蛍光は見られませんので、やはりマニキュ >アそのものがシグナルをエンハンスする作用があるのかもしれませんね。マニ >キュアはどのように塗るのが一般的なのでしょうか？ >もしよろしければ教えていただけませんでしょうか。 カバーガラスの端とサンプルの間に余裕がある凍結切片等の場合はいいですが、 マニキュアの下に細胞染色のサンプルがある状態は避けたほうがよいです。 サーモのProlong Diamond等の固化するタイプの封入剤を使って、 マニキュアなしで観察してみてはどうですか。 マニキュアに代わる、染色結果に影響を与えない シールド専用試薬、というものもあります。 http://www.cosmobio.co.jp/product/detail/covergrip-coverslip-sealant-bti.asp?entry_id=15671

(無題) 削除/引用 No.6201-8 - 2017/08/11 (金) 08:08:39 - AP 記述からは読み取れないけど。実際はそのようにやってるのかな、

(無題) 削除/引用 No.6201-7 - 2017/08/11 (金) 08:05:14 - AP 抗体液を上に乗せて放置というのは良くないかも。薄層の液体だからメニスカスや蒸発の影響で不均一になるし、自由拡散も制限されるだろう。 うちではパラフィルムに抗体液を乗せて、その上にカバーグラスを伏せて置く流儀。

(無題) 削除/引用 No.6201-6 - 2017/08/11 (金) 06:23:14 - mon 抗体の非特異的吸着はBSAでもある程度防げます。そのため、私は基本的には細胞が剥がれやすくなるdetergentは使いません。 BSAが濃いと染色が弱いときもあるので(BSAをケチる意味もある）ブロッキングは1%BSA、抗体希釈液や洗浄液には0.1%BSAを多用しています。なお染色数が多いときには検討後洗浄液にBSA添加なしPBSを使用します。 それでも非特異的吸着防げないときは、固定法を変える、BSAの代わりに2次抗体と同種の血清やFishゼラチンを使うなど色々試します。

(無題) 削除/引用 No.6201-5 - 2017/08/11 (金) 02:16:23 - 細胞染色 Tracker様、 そうなのですか！？知りませんでした。。。 スライドガラスにマウントする方法ですが、パラフィルムの上で染色しおえたガラスをピンセットでつまみ、キムワイプで細胞面に触れないようにできるだけ多くの洗浄液（PBS）を除きます。 その後、スライドガラス状に10マイクロリットルほどのマウンティングメディア（サーモの蛍光退色防止剤入りのものです。）を垂らしたところへ、細胞面を下にゆっくり貼り付けるようにしておいています。 その後、ガラス表面をp200チップでぎゅっと押して余分なマウンティングメディアを出してそれをアスピレータで吸引除去したのち、速やかにマニキュアで辺縁部とスライドガラスを股にかけるように塗っています。 確かに強く光っているところはマニキュア越しに見ていたのかもしれせんね。。 ちなみにアイソタイプにはそのような蛍光は見られませんので、やはりマニキュアそのものがシグナルをエンハンスする作用があるのかもしれませんね。マニキュアはどのように塗るのが一般的なのでしょうか？ もしよろしければ教えていただけませんでしょうか。 そして、確かに中央部は細胞が剥がれていますし、形態がうまく保持されていない印象です。 Tracker様はどのような界面活性剤を入れていますか？抗体反応時には非特異的吸着を防止する目的で入れていますか？もしよろしければ教えていただけますと幸いです。ありがとうございます。 >[Re:3] Trackerさんは書きました : > スライドガラスにマウントする際にはどのように行っていますか？ > マニキュア等で縁をかこむとその部分(=辺縁部)が強く光ったりしますが...

(無題) 削除/引用 No.6201-4 - 2017/08/10 (木) 23:43:02 - 細胞染色 mon様、ありがとうございます。 細胞は線維芽細胞なのですが、剥がれていませんでした。 受け継いだプロトコル通りやっていたのですが、剥がれる可能性もあるとのことでもう少し調べてからやるべきでした。ありがとうございます。 抗体希釈液にはデタージェントは一般的に入れるものと考えていました。 非特異的な吸着を防ぐためとの理解です。 実はPBSTで洗浄を行うと、十中八九シグナルが消失するという問題が生じており、PBSにしたところ解決しました。もしかしたら染色のムラというのもTriton X100が原因で、tween20ならムラなくそまるのかもしれませんね。ありがとうございます。試してみます。 >[Re:2] monさんは書きました : > MetOH固定で、Triton X100って細胞剥がれませんか？ > MetOH固定で細胞膜は無くなっているので、膜透過処理としてTriton X100は不要でしょう。 > 抗体希釈液としてもTriton X100は不要でしょう（洗浄液にも含まれていないし）。入れるとしてもtween20かな。 > >アスピレータでglass表面の液をできるだけとろうとします > アスピレータが良いか否か不明ですが、私はキムワイプを端ギリギリに載せて（そえて）、余分な液を吸い込みます。

(無題) 削除/引用 No.6201-3 - 2017/08/10 (木) 23:40:17 - Tracker スライドガラスにマウントする際にはどのように行っていますか？ マニキュア等で縁をかこむとその部分(=辺縁部)が強く光ったりしますが...

(無題) 削除/引用 No.6201-2 - 2017/08/10 (木) 15:03:23 - mon MetOH固定で、Triton X100って細胞剥がれませんか？ MetOH固定で細胞膜は無くなっているので、膜透過処理としてTriton X100は不要でしょう。 抗体希釈液としてもTriton X100は不要でしょう（洗浄液にも含まれていないし）。入れるとしてもtween20かな。 >アスピレータでglass表面の液をできるだけとろうとします アスピレータが良いか否か不明ですが、私はキムワイプを端ギリギリに載せて（そえて）、余分な液を吸い込みます。

細胞染色のムラについて（ガラスの中央部と辺縁部の染まり方） 削除/引用 No.6201-1 - 2017/08/10 (木) 13:23:52 - 細胞染色 お世話になります。 現在、24 well plateの1 wellの一回り小さいglass slipをwellにいれ、何もコートせずにそこへ線維芽細胞をまき、翌日、細胞の状態を確認したのちに、cold methanolで5 min固定後、PBSで3回洗ったのち、0.5 % BSA in PBS + 0.05% Triton X100でブロッキングを1 hrしました。 その後、glassをwellからパラフィルム上に出し、その上で免疫染色を開始しました。 方法は上記のblocking bufferに抗体を1-2 ug/mlで希釈したものを100 ul乗せ、2 hrs室温、PBS wash 5 times、二次抗体を1 hr室温、PBS洗浄で封入という流れです。 そこで質問なのですが、glassの中央部と辺縁部の染まり方にかなりの強弱が見られます。 辺縁部一帯が強く染まるのに対して、中央部やそこから少し離れたところでは全く、もしくは弱く染まった程度になる場合が多いです。なぜでしょうか？ これまで抗体反応を50 ulで行っていましたが、液が足りないのだろうかと思い、100 ulにしましたが、改善しませんでした。over nightで抗体反応をさせる人がいますが、それを参考にしてみてもいいのでしょうか？あるいは、PBSで洗浄後に抗体を加える前、アスピレータでglass表面の液をできるだけとろうとしますが、それもやめた方がいいのか、それともマウンティングに問題があるのか、、何か工夫ができるところはありませんでしょうか？

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