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(無題) 削除/引用 No.6208-8 - 2017/08/21 (月) 12:56:49 - おお 固定するほうが一般的かどうかという点については、固定するプロトコールのほうが圧倒的にポピュラーだと思っています。

(無題) 削除/引用 No.6208-7 - 2017/08/21 (月) 12:55:22 - おお 固定するほうが、厳しい条件でプルダウンできるのでノンスペがある程度防げると思います。ただ固定しない方法も考案されています。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15273401

(無題) 削除/引用 No.6208-6 - 2017/08/21 (月) 09:12:57 - Luc 横から失礼します。 私も今、転写因子の解析に興味を持っており、クロマチン免疫沈降に興味があります。 プルダウン前に細胞を固定するというのは一般的なのでしょうか。いわゆる転写制御因子などでの免疫沈降の際には固定が必要そうにも思えますが、転写因子そのものをプルダウンする際の固定の必要性というのはどの程度あるものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6208-5 - 2017/08/14 (月) 16:08:59 - み >[Re:4] みさんは書きました : > １細胞中の標的遺伝子AのCys element−１は１つだとすると、その細胞に１００分子の転写因子が発現していても、釣りあげたい分子はそのうち１つなんじゃないですか？ CysじゃなくてCisだった。。。

(無題) 削除/引用 No.6208-4 - 2017/08/14 (月) 16:07:21 - み 転写因子の発現量が高ければ良いというわけではないでしょう。 １細胞中の標的遺伝子AのCys element−１は１つだとすると、その細胞に１００分子の転写因子が発現していても、釣りあげたい分子はそのうち１つなんじゃないですか？ その転写因子が制御するCys elementが何箇所あるのか知りませんが、感染した細胞の数を増やした方が良いと思います。 薬剤か蛍光蛋白でセレクションして増やせないのですか？ ウイルスで１０％という状況なら、他の導入方法で効率を上げる努力をするのも手かと。 あと御節介な質問ですが、細胞の種類が違えば制御する遺伝子が異なってきますが、線維芽細胞で目的は達成されるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6208-3 - 2017/08/14 (月) 14:45:18 - おお まずスケールに関しては、そこまで網羅的に見るのかなども加えて、いろいろ判断材料があるので一概に言えないでしょう。数個のターゲットをるなら、シーケンスに回せるだけのDNA量があればなんとかなるかもしれません。 指摘がありますが、もし既知のターゲットがあるのなら、少なくともそれがPCRとかで検出できるかは見るべきでしょう。 発現効率はたとえばTetなので誘導できるようなシステムにすればその遺伝子が生育や増殖にふりなものでも、確実な発現を確保できるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.6208-2 - 2017/08/14 (月) 14:16:49 - CD >なぜChIP-seqではそれほど多くの細胞が必要なのか ChIP-seqのライブラリが求めるクロマチン量はPCR回数にもよりますが100pg ~ 10ngくらいでしょうか？エンドの転写因子に対するChIPだと抗原や抗体の種類にもよりますが10millionの細胞を使っても100pgのクロマチンが落ちてこないことはザラだと思います。 過剰発現系ということで、タグつきのタンパクを使えば抗体の問題はクリアできるでしょうから、まずはfeasibleな量の細胞を使ってChIP-qPCRをすればよいのではないでしょうか。そもそもChIP-qPCRでバリデートしないままシーケンスする勇気は私にはないです。その際にクロマチンの量を計っておけば本実験の時にどれくらい細胞が必要になるか推測がつくかと思います。 というか、レンチである必要はあるんでしょうか？線維芽細胞を大量に播いて、普通にPEIとかリポフェクションでTransfectionした細胞を使うでは駄目なんですか？

ChIP-seqに関しまして。 削除/引用 No.6208-1 - 2017/08/14 (月) 02:19:05 - YK 大変初歩的な内容で恐縮していますが、ChIP-seqに関しまして質問させてください。 私は今、興味ある転写因子の標的遺伝子をChIP-seqを利用して同定できないか考えています。 細胞は、線維芽細胞に転写因子をレンチウイルスベクターを利用して感染、発現させたものを用いる予定です。転写因子の強制発現なので、データの解釈は慎重に行う予定ですが、まずは強制発現細胞であたりをつけ、絞り込んだ遺伝子に関して、通常のChIPを非感染細胞で行おうと思っています。（バリデーション） クロマチンのソニケーションに関しては、Covaris社のtruChIPTM Chromatin Shearing Kitおよび専用のAdaptive Focused Acoustics(AFA)-based chromatin shearingのソニケーターを使用予定です。その後、免疫沈降を行い、NGSを行う予定です。 そこで一つ質問なのですが、ChIP-seqを行うにあたり、元の細胞数を1-3 x 10^7を用意しなくてはならないとありました。残念ながらレンチウイルス感染した細胞は増えが悪く、そこまでの細胞数を用意することが叶いません。感染効率も頑張っても10％ほどしか行きません。今回は転写因子の強制発現細胞なので、内在性の発現レベルに比較して圧倒的に発現していますので、もしかしたら細胞数は少なくても済むのでは？と考えていますが、免疫沈降する転写因子の発現量で元の細胞数を決めるというのは正しくない考えでしょうか？ わかりずらい質問になってしまい恐縮ですが、つまりなぜChIP-seqではそれほど多くの細胞が必要なのかということがお聞きしたいです。もし転写因子の発現量が多ければ、細胞数は少なくても良いのでは？と考えていますが、実際のところどうなのでしょうか？ 大変初歩的な内容で恐縮しています。ChIP-seqも通常のChIPも未経験ですので、このような質問になってしまいました。どうかコメントをいただけますと幸いに存じます。宜しく御願い致します。

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