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(無題) 削除/引用 No.6209-8 - 2017/08/14 (月) 21:17:15 - AP 制限酵素の品質評価に、ligation/recutting というのがありますよね。 その意味を考えれば、ある程度、例外的な反応が起こることは想定内と言えるんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6209-7 - 2017/08/14 (月) 16:04:14 - おお いろいろなことがあるでしょうけど、すでにそれぞれ指摘があります。一方の制限酵素だけで切れた場合とか、大腸菌内で削られたりして繋げられてしまったり。 前者はテクニカルな問題ですが、後者はそれによって一定量のコロニーができたりしますので、ライゲーションがうまく行ってなかったりした場合、そういったハズレばかりといったことになるので（これは前者の場合にもあたりますが）、起こりにくいから無視できるということでもないと思います。

(無題) 削除/引用 No.6209-6 - 2017/08/14 (月) 14:50:38 - セルフライゲーション 独り言さん なんどもお返事いただきましてどうもありがとうございました。 私自身の実験には問題ないのですが、ふと疑問に思ったので投稿させていただいた次第です。 割合としては非常に低いということもなんとなく予想はしていました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.6209-5 - 2017/08/14 (月) 14:05:06 - 独り言 > > http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=344 > > この記事が気になって質問しました。 おそらく、それぞれの突出末端が結合するのではなく、突出末端は一本鎖なので、不安定なため、削り込みがおき（おそらくミニプレ産物の不純物とかで）、平滑末端がライゲーションするのだと思います。ただ頻度はかなり少ないので、インサートのライゲーションが普通の効率でいっていれば、問題ないです。

(無題) 削除/引用 No.6209-4 - 2017/08/14 (月) 13:47:24 - AP No.344-10 に書きましたように （alkali lysisでとったプラスミドである限り）制限酵素で完璧に切れることはまれなので、切れ残りがかなりのコロニーを生じるのは普通です。 >制限酵素で切ったDNAはほとんどがcutされているはずですが。。。 ほとんどがカットされているはずってそりゃ程度の問題で、ほとんど切れていていようと、切れていないのが混じっているということが問題なのは間違いない。 たとえば、電気泳動でチェックするサンプル中あるいは形質転換に使用するライゲーション産物に、切れ残りが1 pgまじっていたとしても電気泳動じゃあ見えない、でもそれによって並のコンピなら10の二乗オーダーのコロニーを生じます。 ためにしugオーダーのプラスミドを制限酵素消化してすべてゲルで流してみな。 きっと切れ残りのcccが見えっから。

(無題) 削除/引用 No.6209-3 - 2017/08/14 (月) 12:53:33 - セルフライゲーション 独り言さん http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=344 この記事が気になって質問しました。

(無題) 削除/引用 No.6209-2 - 2017/08/14 (月) 12:47:48 - 独り言 EcoRIとXhoIの末端が結合することはありません。 コロニーが生えて来るのは、EcoRIもしくはXhoIのどちらかしか切れていない、切れ残りがセルフライゲーションしたものだと思われます。 ほとんどcutされていたのは何で確認したのでしょうか？電気泳動ですか？電気泳動では100％カットされたかどうか確認できるほど感度よくないですよね。 例えば99％きれたとしても、1ugのプラスミドであれば、1%の切れ残りはかなりの分子数（モル数）あるので、簡単にセルフライゲーションされたものがでてきます。

セルフライゲーションについて 削除/引用 No.6209-1 - 2017/08/14 (月) 12:32:12 - セルフライゲーション セルフライゲーションに関する質問です。 例えばコンパティブルエンドではない制限酵素２つ、例えばEcoRI/XhoIで切ったベクターをライゲーションに使疎き、ネガティブコントロールのプレートとしてEcoRI/XhoIで切ったベクターのみをligation mixに混ぜ、トランスフォーメーションすると思います。 その際、コロニーが生えて来ますが、これはEcoRIとXhoIとの間でライゲーションが起こっているのでしょうか？制限酵素で切ったDNAはほとんどがcutされているはずですが。。。 ご存知の方宜しくお願いします。

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