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コロニーができない（コンピテントセルの活性低下？） トピック削除
No.6222-TOPIC - 2017/08/18 (金) 16:34:49 - うど
ｍRNA→ｃDNAを鋳型としたRT-PCRによって得たサイズ400~500 boの産物のクローニングを行っています。インビトロジェンのTOPO TA cloning kitとOne Shot TOP10ケミカルコンピテントセルを使用していますが、ここ数ヶ月、以前よりもLB/Amp培地に蒔いたときのコロニー数が著しく少なく (<5~10)、コロニー形成も遅い (>16~20h)ことが続いています。キット、コンピテントセルともに購入から1年強がたっています。

クローニングする遺伝子、同一遺伝子でもプライマーセットが違う場合、形質転換での濃度が違う場合でも同様にコロニーが少ないです。同時にインサート量を振ることはしていませんが、これまでインサート量 (ng) はベクタに対して過剰 (1:5~10程度)でも生えていました。

このところ通常-80℃のディープフリーザーが不調なのか、たまに-65℃くらいまで上がっていることなどがあり、コンピテントセルが死んでいるか、活性が下がっているかもしれないと思っています。

皆さんで似たような経験がお有りの方や、他の問題をご指摘いただければ幸いです。
　
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No.6222-8 - 2017/08/19 (土) 18:54:34 - うど
おお様
＞インタクトのプラスミドで
目的の遺伝子を組込んだ時に生えたコロニー数をもとに出した値なので、コンピテントセルの活性自体を見る指標には不適切でした。
重ね重ね、勉強不足のために不正確な記述、質問で申し訳ありません。

AP様
ご教示いただきありがとうございます。数コロニーでも取れて目的配列が入っていれば良い、というつもりでしたが、初めからコントロールを取って、結果の検討ができるようにしておく必要を痛感しました。

こぴ様
自作だと寿命も幅がでるのでしょうか。

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No.6222-7 - 2017/08/19 (土) 13:53:40 - AP
形質転換効率は、標準的なプラスミド(pUCなど）を少量（例えば0.1 ng)使用して形質転換してcfu/ugを求めなければなりません。
性能が良いもので10^8 cfu/ug、ほどほどで10^7, 長期保存で低能が落ちたもので10^5〜10^6くらいですかね。

正直言って、ライブラリーを作ろうというのでなく、単離した特定の断片をクローニンするくらいなら、10^6もあれば十分じゃないかなあ。

うちでは、数年前の卒業生がInoue/Nojimaの方法で作りディープフリーザーに眠っている自家製コンピでも、問題なく使えてます。

(無題) 削除/引用
No.6222-6 - 2017/08/19 (土) 08:22:46 - おお
>10＾3〜10＾4 (cfu/μg plasmid) で、うまく行っていた (つもり) のときに比べ10＾2以上は低下

インタクトのプラスミドで計算してますか？そういう実験は普段はやらないとは思うので、、、

(無題) 削除/引用
No.6222-5 - 2017/08/19 (土) 00:43:53 - こぴ
自作コンピテントセルを使っていますが、いつも1年くらいでへたるので、そういうものと思って使ってます。皆さんはどうなんでしょう？

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No.6222-4 - 2017/08/18 (金) 17:35:59 - うど
恥ずかしながら、これまで形質転換効率を求めておりませんでしたが、問題としている数回分の実験についてはコロニー数をひかえていたので計算できました。
10＾3〜10＾4 (cfu/μg plasmid) で、うまく行っていた (つもり) のときに比べ10＾2以上は低下しているようでした。それでもメーカーの言う値からかなり低いので、手技・プロトコルを検討し直してみます。

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No.6222-3 - 2017/08/18 (金) 16:53:36 - うど
おお様
ご助言ありがとうございます。確かに実際に調べて解決するか、その上で他の問題が検討可能な話でした。

(無題) 削除/引用
No.6222-2 - 2017/08/18 (金) 16:41:07 - おお
＞活性が下がっている
これは実際に活性を調べることができますよね。かもしれないを前提にすると判断をあやまりかねないですよ。

コロニーができない（コンピテントセルの活性低下？） 削除/引用
No.6222-1 - 2017/08/18 (金) 16:34:49 - うど
ｍRNA→ｃDNAを鋳型としたRT-PCRによって得たサイズ400~500 boの産物のクローニングを行っています。インビトロジェンのTOPO TA cloning kitとOne Shot TOP10ケミカルコンピテントセルを使用していますが、ここ数ヶ月、以前よりもLB/Amp培地に蒔いたときのコロニー数が著しく少なく (<5~10)、コロニー形成も遅い (>16~20h)ことが続いています。キット、コンピテントセルともに購入から1年強がたっています。

クローニングする遺伝子、同一遺伝子でもプライマーセットが違う場合、形質転換での濃度が違う場合でも同様にコロニーが少ないです。同時にインサート量を振ることはしていませんが、これまでインサート量 (ng) はベクタに対して過剰 (1:5~10程度)でも生えていました。

このところ通常-80℃のディープフリーザーが不調なのか、たまに-65℃くらいまで上がっていることなどがあり、コンピテントセルが死んでいるか、活性が下がっているかもしれないと思っています。

皆さんで似たような経験がお有りの方や、他の問題をご指摘いただければ幸いです。
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