全16件 ( 1 〜 16 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.6243-16 - 2017/08/26 (土) 16:43:42 - はな ema様 私のイメージどおりの御回答です。ありがとうございました。 値段が高いのが、ちょっと厳しいので、何かの予算を獲得しないといけないなと思っております。

(無題) 削除/引用 No.6243-15 - 2017/08/25 (金) 21:36:01 - ema 細胞膜を染色する色素は色々あります。 https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/cell-analysis/cell-structure/plasma-membrane.html 生きた状態で外から膜を染めて DuoLinkは近接ライゲーションアッセイなので、たんぱくAにつけれたら、超解像（SIM)かなにかで局在をみれれば。 http://www.sigmaaldrich.com/japan/lifescience/proteomics/protein-detection/duolink.html

(無題) 削除/引用 No.6243-14 - 2017/08/25 (金) 16:55:30 - おお むずかしいねぇ、、、 まず細胞の表面にあるかどうかだったら、細胞を固定せずに抗体と反応し洗ってから固定をするという手が考えられます。 ただしそれでもって検出されないからと言って細胞質側にあるとまでは言い切れないですが、、、というのも膜近傍にあるエンドソームの内側であれば細胞内だけど細胞質側ではないので、、、 生化学的などの手法でGPCR型受容体Bの細胞質側の配列にアフィニティーがあるなどの実験データーもある方が説得力あるかもしれません。それかTagつきGPCR型受容体Bで細胞質側の部分のデリーションミュータントや関係ない配列への置換したものをなどをつくりTagに対する抗体とタンパクAの抗体で２重染色して、結合に関与している細胞質側の配列を見極めるとか。

(無題) 削除/引用 No.6243-13 - 2017/08/25 (金) 15:35:46 - はな あれ？様 そのとおりです。 タンパク質Ａは、分泌タンパクとしての既知の作用以外に、膜タンパク質Ｂの細胞質側領域と結合しておこす新たな作用があるのではないかと考えています。

(無題) 削除/引用 No.6243-12 - 2017/08/25 (金) 14:58:07 - あれ？ 分泌タンパク質Ａが膜タンパク質Ｂの細胞質側領域と結合しているとお考えなのですか？

(無題) 削除/引用 No.6243-11 - 2017/08/25 (金) 14:55:39 - AA >質問者さんは、細胞質側領域に結合しているケースを想定しているので、細胞外の場合を検出するビオチン法だとダメなのでは？ 指摘されると駄目な気もしてきました。。。 細胞表面をビオチン化後、(アビジンカラムを通さずに) Aの抗体でIPし、その後Bの抗体でIBしてバンドが出たうえに、 ・HRP-avidinでバンドが出なければ細胞内のみ ・HRP-avidinでバンドが出れば細胞外にもあり という風に評価できないかなとおもったのですが。。。

(無題) 削除/引用 No.6243-10 - 2017/08/25 (金) 13:34:35 - はな 説明不足の点、すみませんでした。 タンパクAは分泌タンパクです。 APさんに教えていただいた方法も含めて、教えていただいた方法は全て試してみたいと思います。 細胞表面をビオチン化、その後Aの抗体で免疫沈降で、その後に、Bの抗体でウエスタンブロットというのも思いつきました。

(無題) 削除/引用 No.6243-9 - 2017/08/25 (金) 12:53:48 - AP >ところでタンパクAは、細胞外に分泌されるのでしょうか？膜タンパクでないのなら培養上清中に存在しない限り、細胞内で結合していることになるとは思いますけど。 autocrineというセンもある。

(無題) 削除/引用 No.6243-8 - 2017/08/25 (金) 11:43:40 - 横から 質問者さんは、細胞質側領域に結合しているケースを想定しているので、細胞外の場合を検出するビオチン法だとダメなのでは？ ところでタンパクAは、細胞外に分泌されるのでしょうか？膜タンパクでないのなら培養上清中に存在しない限り、細胞内で結合していることになるとは思いますけど。 ラベルしたリコンビナントを加えて、膜に結合しないというのでもいいかもしれませんが

(無題) 削除/引用 No.6243-7 - 2017/08/25 (金) 11:04:21 - AA ph依存性の発色を示す蛍光色素やタンパク質(phRedなど)を使うと、 細胞外(ほぼ中性)と細胞内(弱酸性)の違いから細胞内外を区別することもできます。 あとは共焦点顕微鏡で共局在が見えているのなら、 単純に超解像顕微鏡を使えばある程度は区別できると思います

(無題) 削除/引用 No.6243-6 - 2017/08/25 (金) 10:57:05 - AA アミノ基ビオチン標識は、標識用ビオチン(下記参照例)を、 PBSに溶かして、培地と取り替えて4度で2−30分置いておくだけなので 簡単でいい方法だと思います。 ttps://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/protein-biology/protein-labeling-crosslinking/protein-labeling/biotinylation/amine-biotinylation-reagents.html 死細胞への影響は、タンパクを溶かして回収する以上、 ディッシュ中の大多数が生細胞となるように培養していれば、 特に問題ないんじゃないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6243-5 - 2017/08/25 (金) 10:33:04 - AP 膜透過処理有無、膜を保持した状態でプロテアーゼ処理 からの抗体染色

(無題) 削除/引用 No.6243-4 - 2017/08/25 (金) 09:34:22 - はな ゆ様 早々の御助言をありがとうございます。 なるほど！と思いました。 もう少し、教えてください。 タンパクのビオチン化や、HRP-avidinを用いた、オリジナルのEIA系を開発するなどは経験があります（タンパクAについてもEIA系を開発しました）。 でも恥ずかしながら、”細胞表面のビオチン化”や”免疫沈降”の経験が無いです。細胞表面のビオチン化とは、培養細胞をPBSなどで洗い、その後に、ビオチンを入れて標識するという意味と推察しています。その場合、ビオチンの適量というのはどのように決めていくのでしょうか？ またビオチンにもいろいろありますが、細胞表面のビオチン化に適したもので推薦されるものは無いでしょうか？ それから培養細胞の中には、全てが生きているのではなく、死んだ細胞もまざっていると思います。死んだ細胞の細胞質に、ビオチンが入っていき、測定結果を乱すということは無いでしょうか？ その他、細胞膜の調整や免疫沈降について参考になる文献、あるいは推薦されるキットがありましたら教えていただけるとありがたいです。

(無題) 削除/引用 No.6243-3 - 2017/08/25 (金) 09:20:32 - ゆ まあ界面活性剤を使わずにタンパクAの抗体で染まるかどうかはやってみてもいいかと。 染まるなら細胞外側に。染まらないなら細胞内に。

(無題) 削除/引用 No.6243-2 - 2017/08/25 (金) 08:59:53 - ゆ 細胞表面をビオチン化。その後Aの抗体で免疫沈降。その後、HRP-avidinで検出。

細胞膜の外か中か判るようにする染色法はありますか？ 削除/引用 No.6243-1 - 2017/08/25 (金) 08:56:12 - はな どうぞよろしくお願いします。 ある初代培養細胞で発現する、あるタンパクAについて、蛍光免疫染色をして共焦点顕微鏡で観察しています。 このタンパクAは膜タンパクでは無いのですが、GPCR型受容体Bと、細胞膜上で共存していることを示唆する画像を得ています。たとえば、タンパクAをグリーン、膜型受容体Bをレッドにそめると、共存を示すイエローとして観察されます。Zスタックでみても、そのように見えます。 そこで、なんとか、このタンパクAが膜型受容体Bの細胞質側領域に結合していることを、示すような画像を得られないかと困っています。タンパクAが細胞膜の外か中か判るようにする染色法はないでしょうか？ それから、DICを用いていますが、他に、どこが細胞膜なのかを示すような染色法は無いでしょうか？

全16件 ( 1 〜 16 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---