Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る | トピック一覧 | 研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム(readのみ)

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

全てのシトシンをメチル化したDNA断片 トピック削除
No.6279-TOPIC - 2017/09/05 (火) 14:21:51 - 田中
トピックのものを作製しようとしています。

目的のDNA断片はプラスミドに組み込まれています。
PCRで、dNTPの代わりに、
dm5CTP、dTTP、dGTP、dATPを入れる、
というやり方で行なっていたのですが、
このやり方では、この後の操作までに十分な収量が得られず苦戦しています。
(この後、ゲル抽、ライゲーションなどを行うので、最終産物が足りないという状況です)

何か他の方法がありませんでしょうか?
メチル化DNAを組み込んだプラスミドを大腸菌がそのまま増やしてくれたら
理想的なのですが。。。

素人質問ですみません。
どうかご回答をよろしくお願い致します。
 
- このトピックにメッセージを投稿する -



4件 ( 1 〜 4 )  前 | 次  1/ 1. /1


(無題) 削除/引用
No.6279-4 - 2017/09/05 (火) 15:27:14 - 田中
>APさん
回答ありがとうございます。
メチル化したDNAと、メチル化していないDNAをつなげ、
その物性を見る、という実験です。
プラスミドにつなぐわけではありません。

もともと欲しい配列が、
プラスミドに組み込まれており、
そこから、メチル化断片と非メチル化断片をPCRで増やしています。

「メチル化DNAを組み込んだプラスミドを大腸菌がそのまま増やしてくれたら」
というのは、PCRで、目的配列があまり増えないので、
こんなことができたらいいなという、願望でした。

説明不足ですみません。



dm5CTP置換の二重鎖の性質については初耳でした。
もう一度、プログラムを見直してみます。
ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.6279-3 - 2017/09/05 (火) 14:44:02 - AP
酵素の特性によってdm5CTPの基質に取る効率が違ってたりするのかなあとも思ったんですが、

問題はdm5CTPで置換された二重鎖は安定性が高く変成しにくいのでPCR反応中に鋳型となる効率が下がるからみたいっす。変性条件を上げてやるといいみたいっす。

https://academic.oup.com/nar/article/19/5/1081/1090070/PCR-with-5-methyl-dCTP-replacing-dCTP

(無題) 削除/引用
No.6279-2 - 2017/09/05 (火) 14:31:50 - AP
ちなみに、どういう実験法ですか。
というのは、in vitroでメチル化したDNAをライゲーションして、それから?
大腸菌に入れるんだとしたら、なにをする系なのかなー? 私には未知の実験手法のようなので、

全てのシトシンをメチル化したDNA断片 削除/引用
No.6279-1 - 2017/09/05 (火) 14:21:51 - 田中
トピックのものを作製しようとしています。

目的のDNA断片はプラスミドに組み込まれています。
PCRで、dNTPの代わりに、
dm5CTP、dTTP、dGTP、dATPを入れる、
というやり方で行なっていたのですが、
このやり方では、この後の操作までに十分な収量が得られず苦戦しています。
(この後、ゲル抽、ライゲーションなどを行うので、最終産物が足りないという状況です)

何か他の方法がありませんでしょうか?
メチル化DNAを組み込んだプラスミドを大腸菌がそのまま増やしてくれたら
理想的なのですが。。。

素人質問ですみません。
どうかご回答をよろしくお願い致します。

4件 ( 1 〜 4 )  前 | 次  1/ 1. /1


パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール   アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存(次回の入力の手間を省けます)
上に上げない(トピックの一覧で一番上に移動させません)
解決(問題が解決した際にチェックしてください)
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 

〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。