全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.6286-14 - 2017/09/08 (金) 13:30:12 - Hisタグ苦戦 皆さんリプライありがとうございます。 ようやく目的のバンドを精製できました(夾雑物は多いですが)。 ここからは手法をブラッシュアップしていこうと思います。

(無題) 削除/引用 No.6286-13 - 2017/09/08 (金) 13:01:10 - おお ありがとうございました。問題なく使えそうですね。なぜ相性が悪いと思ったかというのをおもいだしました。たしかRNA精製用のキットで蛋白も取れるけどTCAは使わないほうがいいと書かれていたのがあったのでだと思います。guanidine isothiocyanateが使われているだろうということでそれが主な原因かなとそこから勝手に想像したのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6286-12 - 2017/09/08 (金) 09:40:34 - mon >[Re:11] おおさんは書きました : > グアニジンとTCA沈殿って相性悪くなかったっけ、、、思い違いかもしれないけど。 実験ノートを見直してみました。 9倍量のDDWを加えfinal 5% TCAを加え15000rpm 10分（0.5mLエッペン）沈殿させてました。その後100% EtOHでリンスして乾燥させ、1xSDS sample bufferに溶解。 残存TCAでBPBが黄変するので、1/10量の1M Tris(pH7-8)を加え青色に戻し、加熱・ゲルにロード。 ネットで調べると9倍量のEtOHを加えて沈殿させるprotocolも有るようです。 Useful method to concentrate proteins and removal of Guanidine Hydrochloride before SDS-PAGE 1. Add to 1 volume of protein solution 9 volumes of cold ethanol 100%. 2. Mix and keep at least 60 min. at -20°C. (Suggestion: leave ON). 3. Centrifuge 10 minutes at 15,000 x g. 4. Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper Method: (pellet may be difficult to see). 5. Wash pellet with cold ethanol (keep at -20°C). 6. Vortex and repellet samples for 10 min at 15,000 x g. 7. Aspirate ethanol, avoiding pellet with care 8. Dry samples under vacuum (speed vac) or dry air to eliminate any ethanol residue (smell tubes)

(無題) 削除/引用 No.6286-11 - 2017/09/08 (金) 00:15:30 - おお グアニジンとTCA沈殿って相性悪くなかったっけ、、、思い違いかもしれないけど。

(無題) 削除/引用 No.6286-10 - 2017/09/07 (木) 16:08:02 - mon >[Re:8] Hisタグ苦戦さんは書きました : > グアニジンで可溶化した時の精製の確認はどうされていますか？ > SDS-PAGEするために毎回バッファー置換などされるのですか？ たしかTCA沈殿＞SDSサンプルバッファー(+Tris 1-2粒：BPBが青変するまで）に溶解したと思う。。

(無題) 削除/引用 No.6286-9 - 2017/09/07 (木) 15:47:33 - おお アセトンで蛋白を落として、アセトンかアルコールであらって風乾ごサンプルバッファーかウレアを加えて溶解。ウレアなどの存在下でスピンカラムっていう手もあるかもしれませんけど、気をつけないとわけがわからなくなるかも・

(無題) 削除/引用 No.6286-8 - 2017/09/07 (木) 14:12:19 - Hisタグ苦戦 グアニジンで可溶化した時の精製の確認はどうされていますか？ SDS-PAGEするために毎回バッファー置換などされるのですか？

(無題) 削除/引用 No.6286-7 - 2017/09/07 (木) 13:57:42 - おお 可溶化しないのか、可溶化するけどカラムにつかないのか、カラムについたけど溶出できないのかで対処方法が異なります。カラムにつかないのならイミダゾールの濃度を下げるのも一つの選択肢です。メーカーが出すプロトコールは標準的なものですべてのケースでうまくいくとは限りません。 尿素による可溶化にイミダゾールはそれくらいの濃度ならあまり影響ないと勝手ですが想像しています。それで可溶化しないならグアニジンなど使うのも手かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6286-6 - 2017/09/07 (木) 13:26:30 - mon もし、カラムに結合しないなら、結合バッファーのpHをチェックしてください。リン酸バッファーは塩濃度によってpHが変わる可能性がありますし、イミダゾールもpHに影響するするかもしれませんし。なお、Ureaを含む溶液は用事調製が好ましいです。 また、Ureaでは完全に可溶化できていないのかもしれません。6M塩酸グアニジンを含む結合バッファーに変えると良いかも。

(無題) 削除/引用 No.6286-5 - 2017/09/07 (木) 12:01:34 - う いいのでは。基本的には結合バッファーとにたような組成になるのでは？ それより精製がうまくいかないというのは具体的にはどういうことですか？ 溶出物が精製されていない？ カラムから溶出されてこない？ カラムに結合していない？ などです。まずはうまくいかないということを説明すべきだと思います。

(無題) 削除/引用 No.6286-4 - 2017/09/07 (木) 11:47:53 - Hisタグ苦戦 説明不足ですいません。 結合バッファーのイミダゾール濃度はプロトコール遵守しているので問題ないと思います。 不溶性タンパクを可溶化するバッファーにイミダゾールが入ってていいのか知りたいです。

(無題) 削除/引用 No.6286-3 - 2017/09/07 (木) 11:39:55 - み 樹脂に結合させる時のimidazole濃度は5-10mMでじゅうぶん非特異的結合は防げると思う（今までの経験上の話）。 30mMでのトラップはやったことない。

(無題) 削除/引用 No.6286-2 - 2017/09/07 (木) 11:16:48 - う 30 mMでそれほど影響あるかしら。

不溶性タンパク(Hisタグ付き)の可溶化・精製について 削除/引用 No.6286-1 - 2017/09/07 (木) 10:17:33 - Hisタグ苦戦 現在不溶性タンパクを可溶化して、Ni Sepharose 6FFで精製するのに苦戦しています。 不溶性タンパクはNi Sepharose 6FFの結合バッファー(20mMリン酸ナトリウム、0.5M NaCl 30mMイミダゾール 8M urea pH7.4)で可溶化しています。 そこで、思ったのですが不溶性タンパクをイミダゾール入りのバッファーで可溶化しているために精製がうまくいかないのでしょうか？ もし可溶化するならurea入りのPBSなどのほうが良いのでしょうか？ 教えてください。

全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---