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(無題) 削除/引用 No.6323-8 - 2017/09/18 (月) 08:56:12 - おお >やはり塩とアルコールでは塩の析出が起きますよね。。 DNAが沈殿する可能性を言ってるんです。RNAのキットではイソプロパノールが入った状態にして、遠心するとRNAをロスするのでそのまま乗っけます。沈殿がSDSなどであればWashでおちます。

(無題) 削除/引用 No.6323-7 - 2017/09/18 (月) 07:26:49 - ChIP初心者 おおさん、ありがとうございます。 バンド、出ませんでした。。。やはり塩とアルコールでは塩の析出が起きますよね。。 沈殿物は除いてしました。沈殿のままカラムにのせたらスピンカラムが壊れてしまうのでは？と思い、除去しましたが、幸い沈殿物は残しておいたので、、、うーん。。やってみます。ありがとうございます。 ちなみにおおさんは、リバースクロスリンク時に塩は加えていますか？加えていないプロトコルも散見されましたので、少し気になって。すみませんが、また教えてください。 >[Re:6] おおさんは書きました : > >PBバッファーを5倍量入れたら何かが析出しました。。。。。。。 > > バッファーにアルコールが入っているのでもとの溶液の塩など混入物によってはDNAは沈殿する傾向にあるのでは？析出する物ごとカラムにのっけるのがベターとおもえる。あとはSDSが入っていたら析出するかも。それもカラムに載っけてしまってもいいと思われる。

(無題) 削除/引用 No.6323-6 - 2017/09/18 (月) 04:59:57 - おお >PBバッファーを5倍量入れたら何かが析出しました。。。。。。。 バッファーにアルコールが入っているのでもとの溶液の塩など混入物によってはDNAは沈殿する傾向にあるのでは？析出する物ごとカラムにのっけるのがベターとおもえる。あとはSDSが入っていたら析出するかも。それもカラムに載っけてしまってもいいと思われる。

(無題) 削除/引用 No.6323-5 - 2017/09/18 (月) 02:42:45 - ChIP初心者 PBバッファーを5倍量入れたら何かが析出しました。。。。。。。 一度遠心して、その上澄み5mlをカラムにかけました。どうなることやらですね。

(無題) 削除/引用 No.6323-4 - 2017/09/17 (日) 23:27:47 - ChIP初心者 おおさん、ありがとうございます！ 拝見しました。 キアゲンのカラムでもいけそうなんですね。友人もそれでOKとは言っていたのですが、ダブルチェックとしてお聞きしてよかったです。そして有益な情報も得られました。 プロK処理後、サンプルをPBバッファーで3-5倍希釈してから、スピンカラムにアプライすると書かれてありました。これまで希釈無しで行っていたので、一度希釈を試してみます。 ちなみにですが、溶出後に塩を加え入れるプロトコルとそうでないプロトコルを見ました。どちらもその後、リバースクロスリンクで65度、オーバーナイトをしていました。塩の効果というのはリバースクロスリンクに影響するのでしょうか？質問に質問を重ねてしまい恐縮ですが、ご存知でしたら教えていただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.6323-3 - 2017/09/17 (日) 22:14:35 - おお 2.5 DNA Purification Qiagen MinElute PCR kit or equivalent (see Note 7). https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4349432/#FN7

(無題) 削除/引用 No.6323-2 - 2017/09/17 (日) 22:08:23 - おお http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/41448.html

ChIP後のDNA回収方法 削除/引用 No.6323-1 - 2017/09/17 (日) 21:50:26 - ChIP初心者 質問させてください。 ChIPをやり始めました。特殊な生物種を使っているので、ポジコンが置けない中、探り探り行なっています。一点、確認したいことがありまして、質問させていただきたいです。よろしくお願い致します。 ビーズからSDS, NaHCO3にて溶出後、オーバーナイトでリバースクロスリンクさせます。その後、プロテアーゼK処理した後のDNA精製方法についてお聞きしたいです。 プロトコルにはフェノクロ沈殿で精製するとありましたが、これを次のようにしておられる方はいらっしゃいますでしょうか。つまり、SDS, NaHCO3の溶出バッファーをプロテアーゼK処理後、そのままキアゲンのPCR purification kitやキアゲンのminiprep kitに付属するスピンカラムに供し、精製するというものです。この時プロKのふかっせいは特にせず、スピンカラムをプロトコル通り洗浄だけでProKは除けると予想しています。 みなさんはどのようにDNAを回収しておられますでしょうか。 大変初歩的な質問で恐縮なのですが、よろしくお願いいたします。

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