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(無題) 削除/引用 No.6329-11 - 2017/09/23 (土) 14:21:36 - １qw２え３r４t５ sample中に剪断されてない大きなDNAとか脂質とかが非常に沢山ふくまれているとゲルのトップの方に溜まってそんな風になったきがします。あるいは非イオン生の界面活性剤とか多量に含まれていることはないですか。泳動を妨害するサンプル中の夾雑物の有無について一度検討下さい。

多分 削除/引用 No.6329-10 - 2017/09/22 (金) 21:24:36 - ふみ ブロッキングバッファでなくて、ブロッティングバッファ(= トランスファーバッファ)の書き間違いですよね。 それで、私は、5分でなくて20-30分平衡化しています。その前のメタノール浸すのは30秒よりも短くて馴染むまでのちょっとの間。メタノールに浸すのが長くても問題ありませんが。

(無題) 削除/引用 No.6329-9 - 2017/09/22 (金) 13:12:05 - 774R 時間が経てばメタノールとバッファーは混じり合って平衡化するはずなので、転写の最中に十分に親水化するとは思うけど、高濃度のメタノールに触れた瞬間にゲル表面のタンパク質が固定されて転写にムラが出来たりしたのではないかと・・・ 高分子のタンパク質ほどメタノールで変性すくて、低分子側は割と影響を受けなかったのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.6329-8 - 2017/09/22 (金) 11:46:06 - おお ブロッキングバッファーって多分ブロッキングのミルクとか入ってないだろうけど、、、たしかにメタノールから直で使ったのが原因かも（したことないのでわからないけど）。普段わたしはメタノール処理後トランスファーバッファーに置換してますけど。

(無題) 削除/引用 No.6329-7 - 2017/09/22 (金) 03:23:42 - ECMタンパク質 みなさま、ありがとうございます。 膜をポンソー染色すると、やはり染まりに大きなムラがでましたので、転写の操作か電気泳動が原因と思われます。 隣の人と操作を一つ一つ机の上で確認しました。 すると、PVDF膜をメタノールに浸した後、ブロッキングバッファーで平衡化を全くしていないことが大きな違いでした。私はメタノールで30秒ほど浸したのち、それをすぐさまゲル、スポンジと組み合わせ、ウエット式で転写していました。もしかしたら親水化が十分ではなく、その部分がタンパク質の転写を妨げたのではと考えています。 次回は平衡化を最低でも5分は行い、繰り返して見る予定ですが、果たしてこれがクリティカルなのかどうかはわかりません。

(無題) 削除/引用 No.6329-6 - 2017/09/22 (金) 00:54:23 - あか 私も基質の枯渇には見えないですね。パッと見た印象は高分子あたりのゲルがぼろぼろしてる？です。トランスファー準備のときメンブレンやスポンジと重ねてぎゅっとしすぎてつぶしてしまったか、トランスファーのバッファーが少なくて上の部分が乾いてしまった状態だったとかないでしょうか。向かって左から2番目のバンドのくの字から3番目の左のほうは大きく気泡かな？あるいはゲルが割れているようにみえるかな、左から2番目のくの字の下のほうに薄く丸く気泡っぽいのがあるかもな、といった印象です。あるいはスタッキングゲルにサンプルがとどまっている状態で、トランスファーのときにそのゲルを壊してしまった、乾かしてしまったのかな？とか。ゲルは自作ですかね？私だったら別の人にゲル作成と、トランスファーの準備をしてもらって比較するかな。あるいはちょっと高いですが作成済みのゲルを買って試すか、ですね。

(無題) 削除/引用 No.6329-5 - 2017/09/21 (木) 20:58:32 - 中年 基質が枯渇して起こる白抜けはシグナルが一番強いところで起こるので、たとえばfat bandの中央などで起こります。画像を見るかぎりそれには当たらないようですね。長時間のブロットでメンブレンとゲルの間に隙間が出来たのかも。

(無題) 削除/引用 No.6329-4 - 2017/09/21 (木) 15:26:25 - おお ゲルがわれているようにもみえるねぇ。。。たとえばCBBとかで染めたあとゲルドライアーで乾かして乾かしそこねた部分のゲルが割れて割れたものが縮んで、示されたような感じになることがある。 それかゲルがこびりついてるかな気が付かないレベルかも知れませんけど。泡っぽくはないし、ECL、基質の枯渇のようにも見えない。

(無題) 削除/引用 No.6329-3 - 2017/09/21 (木) 14:49:23 - ECMタンパク質 sit様、ありがとうございます。 確かにtransferがうまく行っているかどうかはポンソー染色でわかりそうですね。ありがとうございます。 ですが一度やったんですが、高分子量すぎて何も見えなかったんですよね。ですがもう一度行ってみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6329-2 - 2017/09/21 (木) 14:35:37 - sit ゲルとかメンブレンをクマシーとかポンソーで染めてみると、 ある程度問題点を絞り込めるかもしれません。

ウエスタンフィルムの白抜け？気泡？ 削除/引用 No.6329-1 - 2017/09/21 (木) 14:20:17 - ECMタンパク質 大変初歩的な質問で恐縮していますが、ウエスタンのフィルムで毎回、白抜けのような気泡のようなものに苦しんでおります。どうかアドバイスをいただけますと嬉しいです。 画像はファストピックにアップロードしています。 fastpic.jp/images.php?file=2625703764.jpg 抗体はフィブリノゲンに対する抗体でサンプルはマウス組織です。 ウエスタンは何度も行って来ましたが、このタンパク質に関しては毎回このようになります。 分子量は200を超えるため、wet transferでオーバーナイトもしくは4時間で行っていますが、どちらでもこのようになり、また別のサンプルを調整しなおしても、別のゲルを調整して行ってもこのようになります。 過去のトピックでは白抜けはタンパク質が過剰量のためECL基質の消費が早くなるというのが原因の一つになっているようですが、今回もそうでしょうか？それとも気泡の問題でしょうか？ 同時にGAPDHも行なっており（下のシャープなバンドがそうです）、それでは問題なく検出されています。 GAPDHとfibrinogenは同じフィルム露出時間です。 タンパク質を乗せすぎなんでしょうか？50 ug程度なのですが。 GAPDHと同じexposure timeなら、もっとロード量を減らしても検出は可能かもしれませんが。 何が問題として他にあげられますでしょうか？ アドバイスをいただけますと幸いです。

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